抗松针褐斑病湿地松体细胞的悬浮培养

方珞 吴小芹

（1. 南京林业大学南方现代林业协同创新中心，南京 210037；2. 南京林业大学林学院，南京 210037）

湿地松（Pinus elliottiiEngelm）为松科，松属树种，原产于美国东南部湿润暖热的低海拔地区（600 m以下）。我国湖北、浙江、江西、江苏、安徽、福建等地均有引进栽植。湿地松是一种良好的用材及经济树种，高产松脂，木材收益率高；其次，还是很好的园林绿化树种，既抗旱又耐涝、耐瘠，又有着良好的适应性和抗逆性，对松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）和松毛虫（Dendrolimus superans）具有较高的抗性，已成为我国南方重要的造林绿化树种之一［1］。然而，1978年后，松针褐斑病（Lecanostictaacicola）在我国湿地松人工林中接连发生，这使得湿地松在我国的应用受到了较严重的制约［2-3］。所以探寻松针褐斑病的防治方法显得十分迫切，国内外都对此病害进行了一些研究，但目前还没有找出有效的防治办法。因此，培育抗病性强的湿地松的优良家系成为规模造林的重要途径。自20世纪80年代初，我国已展开了对抗松针褐斑病湿地松优良家系的筛选，并建立了湿地松抗病种子园［3］。但由于种子园中种子产量的限制，且种子质量会受天气等影响，制约了优良抗性湿地松的大量繁殖与推广。为了将优良的抗性湿地松家系较快的应用到林业生产中，完善抗性湿地松体细胞胚胎发生技术变得十分重要。

关于针叶树种的细胞悬浮培养研究已经有一些报道，国外学者Hakman等［4］在1985年使用了白云杉（Picea glauca）细胞进行了悬浮培养试验。由于在悬浮培养中，细胞是完全暴露在营养液内，所以对培养的环境十分敏感，对培养条件的要求较高。在针叶树体细胞的悬浮培养中，影响其生长状态的因素很多。有报道称杉木（Cunninghamia lanceolata）悬浮细胞培养时间过长时（超过10 d），悬浮细胞会发生褐化甚至死亡的现象［5］。有研究发现，火炬松（P. taeda）胚性愈伤组织的悬浮培养继代时间对愈伤组织胚性的保持和体胚分化有着显著的影响［6］。

目前，关于湿地松体细胞的悬浮培养尚未见报道，南京林业大学松属植物组织培养课题组已在选育优良抗性湿地松家系的基础上，对抗性湿地松未成熟合子胚进行体胚发生技术的研究，筛选出适宜的胚性愈伤组织固体增殖培养基、培养条件等，并初步获得再生植株［7］。

本研究对抗松针褐斑病湿地松体细胞悬浮培养的基本培养基、培养周期、激素及继代添加比等进行初步探究，旨在建立抗松针褐斑病湿地松体细胞悬浮培养体系，以期获得大量较佳的胚性愈伤材料，为进行抗性湿地松体胚发生、规模化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

材料取自2015、2016年诱导获得的抗性湿地松胚性愈伤组织13#-3、13#-9、12#-1、12#-3、12#-9、7#-4和30#-4共7个无性系。将其放在胚性愈伤组织增殖培养基（LP+0.3 mg/L 6-BA+0.3 mg/L KT+1 mg/L NAA［8］）上培养至10 d，待悬浮培养使用。

1.2 方法

1.2.1 增殖培养 称取1 g增殖状态较佳抗性湿地松胚性愈伤组织，放入倒有30 mL液体培养液的100 mL三角瓶中，并用镊子轻轻打散至均匀，用膜将瓶口封口，放于振荡培养箱中暗培养7 d［9］。

1.2.2 细胞沉降体积（Sedimentation Volume Cell）的测定 将培养7 d的悬浮细胞液倒入100 mL量筒中，残留在量筒壁上的悬浮细胞团，可加入清水震荡后倒入量筒中。静置1 h后，读取沉降在量筒底部的胚性愈伤组织体积即为细胞沉降体积。

1.2.3 细胞活力（OD值）的测定 将悬浮培养7 d的胚性愈伤组织悬浮液使用布氏漏斗法使得培养液与胚性愈伤组织分离。用分析天平称取200 mg胚性愈伤组织，置于5 mL的离心管中，加入2.5 mL 0.4%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液以及2.5 mL 0.1 mol/L的磷酸钠缓冲液，放入25℃的恒温培养箱中暗培养13 h。然后，用吸管去除上清液，加入5 mL清水洗涤3次，加入5 mL 95%无水乙醇，震荡，60℃恒温水浴30 min，水浴期间需振荡几次，至胚性愈伤组织无色后，用紫外分光光度计（Nanodrop ND-100紫外分光光度计，美国Nanodrop公司）中测其上清液OD485nm值，即为细胞活力［10］。

1.2.4 不同培养方式的胚性愈伤组织形态观察与体胚成熟分化测定 以胚性愈伤组织7#-4、30#-4和30#-13为材料，称取1 g胚性愈伤组织，放入30 mL新鲜培养液的三角瓶内，悬浮培养液成分为激素减半的增殖培养液（LP+0.15 mg/L 6-BA+0.15 mg/L KT+0.5 mg/L NAA），用镊子轻轻将其细胞团打散。封口，置于恒温振荡培养箱中培养7-9 d，取出，同时取在增殖培养基上进行固体增殖14 d的胚性愈伤组织，用醋酸洋红和伊文思蓝进行细胞染色。蔡司体视镜（SteREO Discovery.V20）观察记录细胞的状态。并将两种培养方式得到的愈伤组织转接至成熟分化培养基（LP+70 mg/L ABA+180 g/L PEG8000+1 g/L活性炭、麦芽糖60 g/L和植物凝胶3 g/L）进行体胚的诱导，2-3个月后观察体胚发生情况。

1.2.5 基本培养基的筛选 以胚性愈伤组织30#-4作为实验材料，分别以1/2 LP、1/2 DCR、1/4 LP和1/4 DCR为基本培养基，1/2和1/4均指激素减量，统一加入6-BA、KT和NAA 3种激素，即1/2为添加0.3 mg/L 6-BA+0.3 mg/L KT+1 mg/L NAA，1/4为添加0.15 mg/L 6-BA+0.15 mg/L KT+0.5 mg/L NAA。振荡培养箱暗培养7-9 d后，分别测其细胞沉降体积和细胞活力OD值。

1.2.6 培养周期细胞活力的测定 以胚性愈伤组织30#-4作为实验材料，以1/4 DCR为基本培养基，振荡培养箱中暗培养，分别在培养0、3、5、7、9、11、13、15和17 d取样，测其细胞沉降体积和细胞活力OD值。

1.2.7 不同基因型细胞活力的测定 以胚性愈伤组织13#-3、13#-9、12#-1、12#-3和12#-9及30#-4为实验材料。以1/4 DCR为基本培养基，振荡培养箱暗培养7-9 d后，取出测其细胞沉降体积和细胞活力OD值。

1.2.8 NAA浓度的测定 以胚性愈伤组织30#-4作为实验材料，以1/4 DCR为基本培养基，激素统一加入6-BA和KT 2种，添加量为6-BA+0.15 mg/L KT。 分 别 取 NAA 浓 度 为 0、0.5、1、1.5和 2.0 mg/L，放入振荡培养箱暗培养7-9 d后，分别测其细胞沉降体积和细胞活力OD值。

1.2.9 麦芽糖浓度的测定 以胚性愈伤组织30#-4作为实验材料，以1/4 DCR为基本培养基，激素统一加入6-BA、KT、NAA三种，添加量为6-BA+0.15 mg/L KT+0.5 mg/L NAA。分别取麦芽糖浓度为0、5、10、15和20 g/L。放入振荡培养箱暗培养7-9 d后，分别测其细胞沉降体积和细胞活力OD值。

1.2.10 继代添加比的测定 以胚性愈伤组织30#-4作为实验材料，以1/4 DCR为基本培养基，激素统一加入6-BA、KT、NAA 3种，添加量为6-BA+0.15 mg/L KT+0.5 mg/L NAA。振荡培养7-9 d后，取出进行继代培养。本实验设计4种继代添加比，即用移液枪取在培养7-9 d的30 mL初代悬浮细胞液中2/3（即原液取20 mL，新鲜营养液取10 mL）、1/2（即原液15 mL）、1/3（即原液10 mL）、1/6（即原液5 mL）的原液，并分别加入新鲜营养液至30 mL。放入振荡培养箱暗培养7-9 d后，分别测其细胞沉降体积和细胞活力OD值。

1.2.11 培养条件 除非特别说明外，以上实验所配培养基均添加麦芽糖：15 g/L，肌醇：1 g/L，谷氨酰胺：0.45 g/L，水解酪氨酸：0.5 g/L，抗坏血酸：5 mg/L，0.15 mg/L 6-BA，0.15 mg/L KT，0.5 mg/L NAA，pH 5.8，暗培养，培养时间7-9 d。每个处理设置3个重复。

1.2.12 数据统计与处理 分别使用沉降细胞体积和细胞活力OD值作为评价胚性愈伤组织悬浮培养体系优劣的标准。使用Excel 2007进行数据统计分析。

2 结果

2.1 不同培养方式的胚性愈伤组织形态观察与体胚成熟分化的测定

双染色法处理的胚性愈伤组织，胚头部分为红色，胚柄部分为蓝色。抗性湿地松胚性愈伤组织经悬浮培养7-9 d后得到的悬浮细胞相较于固体培养13-15 d的胚性愈伤组织，有一定差异。悬浮细胞在形态上较为分散，形成一个个具有完整胚头胚柄的胚胎细胞（图1-B）。而固体培养得到细胞较为集中，多为聚集体，即较多的体细胞胚头聚集在一起，胚柄朝外呈发散状，只有少部分胚胎细胞分散开（图1-A）。

图1 抗性湿地松固体培养和悬浮培养的胚性愈伤组织形态

将2种培养方式得到的胚性愈伤组织接入体胚成熟分化培养基诱导2个月，发现固体增殖的胚性愈伤组织可产成熟体胚56个/g，悬浮培养的胚性愈伤组织可产成熟体胚153个/g。由此可得，悬浮培养后的细胞由于其较分散，更容易形成大量的抗性湿地松体细胞胚，且减少因空间不足挤压导致营养无法充分获得而发育畸形的体细胞胚胎（图2）。

在选取的3个基因型中，7#-4不适合悬浮培养，其悬浮培养后几乎无法获得抗性湿地松成熟体胚。30#-4固体培养和悬浮培养后均能获得较多的成熟体胚且差异不大。30#-13悬浮培养后所获得的成熟体胚数量显著高于固体培养所得，因此，并非所有基因型都适合悬浮培养（图3）。

图2 抗性湿地松经固体培养和悬浮培养后体胚成熟状况

图3 不同基因型的抗性湿地松胚性愈伤组织经固体及悬浮培养后体胚成熟状况

2.2 基本培养基对抗性湿地松体细胞悬浮培养的影响

从图4可以看出，抗性湿地松悬浮体细胞在供试的4种基本培养基中均可生长，其中体细胞在1/4 DCR中的活力较高，在1/2 LP中次之。但在1/2 DCR和1/4 LP的培养液中，抗性湿地松悬浮体细胞的细胞活力有明显的下降趋势。因此，在保证体细胞正常生长量的前提下，选取1/4 DCR作为抗性湿地松悬浮体细胞培养的基本培养基较佳。

图4 基本培养基对抗性湿地松体细胞悬浮培养的影响

2.3 培养周期对抗性湿地松体细胞悬浮培养的影响

研究发现抗性湿地松悬浮体细胞的生长量在供试期内保持稳定的增加，而细胞活力在培养0-9 d内保持增长状态，至9 d时细胞活力达到最大值，9 d后，虽然细胞仍在生长，但其活力已经明显下降甚至丧失（图5），表明抗性湿地松悬浮体细胞的较佳培养时间为7-9 d，此后，应及时更换培养液进行继代培养。

图5 培养周期对抗性湿地松体细胞悬浮培养的影响

2.4 不同基因型对抗性湿地松体细胞悬浮培养的影响

研究结果（图6）显示，抗性湿地松体细胞悬浮培养在不同的基因型中有一定的差异，在选取的6个基因型中，生长量差异不明显，但细胞活力有较大的差异。13#-9无性系的细胞活力较高，30#-4和12#-3无性系次之，12#-1、12#-9和13#-3无性系较差。

图6 不同基因型对抗性湿地松体细胞悬浮培养的影响

2.5 NAA浓度对抗性湿地松体细胞悬浮培养的影响

图7显示激素NAA对抗性湿地松悬浮体细胞的生长有一定的影响，当NAA浓度较高时，对其细胞的活力有着明显的负面作用，细胞活力显著下降。当NAA浓度大于0.5 mg/L时，则会对体细胞产生不利影响。当NAA浓度为0.5 mg/L时，对湿地松体细胞的活力作用较佳。

图7 NAA浓度对抗性湿地松体细胞悬浮培养的影响

2.6 麦芽糖浓度对抗性湿地松体细胞悬浮培养的影响

研究发现抗性湿地松悬浮体细胞在碳源为麦芽糖的培养液中可以有着较好的生长，在5种浓度下均可保持正常的生长量，在0-15 g/L的麦芽糖浓度时，细胞活力稳定上升，当麦芽糖浓度为20 g/L时，细胞活力产生下降趋势（图8）。因此，麦芽糖浓度为15 g/L时，对抗性湿地松悬浮体细胞培养较适宜。

2.7 继代添加比对抗性湿地松体细胞悬浮培养的影响

图8 麦芽糖浓度对抗性湿地松体细胞悬浮培养的影响

研究结果（图9）显示，抗性湿地松体细胞在经过初代培养后，需定期更换营养液进行继代培养，使其活力得以保持。选取4种继代添加比，其中1/6（即原液取5 mL，新鲜营养液取25 mL）的继代方式，体细胞的生长量较低，不适宜采用。

2/3、1/2和1/3三种继代添加比，均能保持体细胞的正常生长量，其中细胞活力较佳的为1/2，但差异较其他2种并不显著。因此，抗性湿地松悬浮体细胞系继代时，选取2/3、1/2和1/3三种继代比均可。

图9 继代添加比对抗性湿地松体细胞悬浮培养的影响

3 讨论

胚性细胞的成功悬浮培养是获得再生植株并实现规模化生产的重要前提条件之一。悬浮培养首先要保证胚性细胞可以保持较好细胞活力、状态较佳及胚性维持。在此基础上，保持较高的繁殖系数，可以在较短的时间内获得大量胚性材料。

研究发现不同培养方式的胚性愈伤组织的状态各异，悬浮培养的胚性细胞较为分散利于后期成熟获得充分营养，但并非所有基因型都适宜悬浮培养，需根据不同基因型制定较佳的培养方式。

探究悬浮细胞的生长周期是十分必要的，掌握了它的生长周期后，可以选择在其繁殖系数较高、细胞活性较佳的时期进行下一步实验和继代培养。有研究使用欧洲黑松（Pinus nigra）的胚性细胞1 g放入25 mL营养液内培养7 d后，细胞生长量达到最大值［12］，这与本研究中发现抗性湿地松悬浮细胞的较适培养周期为7-9 d是一致的。

悬浮培养营养液中各类能源添加量和植物激素的浓度对胚性愈伤组织有着重要的影响。有报道称将赤松增殖培养基配方中激素浓度减至一半后，细胞可以保持较好的活力进行生长［12］。本实验中得到抗性湿地松体细胞悬浮培养较佳的NAA浓度为0.5 mg/L，正是胚性材料固体增殖中添加量的1/2，这说明在松属树种中激素浓度减半的悬浮培养方式具有一定广谱性。Babula等［13］认为悬浮细胞的继代培养应该降低接种的初始细胞浓度并适量增加培养时间，这使得细胞有足够的时间将生理状态调至较佳，提高细胞活性且能充分利用营养液中的营养。本研究发现，当使用100 mL的锥形瓶装取培养液30 mL时，测得较佳的继代添加比为1/2，悬浮培养7 d后测得细胞活力较佳。

4 结论

初步建立了抗松针褐斑病湿地松悬浮培养体系，抗性湿地松悬浮细胞的较佳培养周期为7-9 d，较适宜的基本培养基为1/4 DCR，麦芽糖添加量为15 g/L，NAA添加量为0.5 mg/L；较佳的继代添加比为1/2；不同基因型的抗性湿地松悬浮细胞在相同的培养条件下，细胞活力有一定差异。