肾上腺素促进胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁徙和侵袭及其潜在机制

翁梅琳 王 敬 杜春春 许平波 钟 静

(复旦大学附属肿瘤医院麻醉科-复旦大学上海医学院肿瘤学系 上海 200032)

人体对急性心理社会应激的自然反应包括“战斗或逃跑”的反应,导致交感神经系统和神经内分泌应激激素的激活。围术期对肿瘤患者的长期预后有重要意义,而患者在围术期可能出现明显的应激。动物实验表明应激激素特别是儿茶酚胺类与卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤进展相关[1]。多个临床前研究证实应激引起的儿茶酚胺释放对肿瘤的发生有影响,包括前列腺癌、结肠癌和乳腺癌等[2-4]。应激可能促进肿瘤微环境中的免疫抑制[5]。儿茶酚胺可以直接作用于肿瘤组织及其微环境,通过β肾上腺素能受体(β adrenoreceptor,β-AR)转导信号,促进癌症的发展、血管生成和细胞凋亡[6-7]。

胶质母细胞瘤是最常见的大脑恶性肿瘤,是星形细胞肿瘤中恶性程度最高的胶质瘤[8]。胶质母细胞瘤生长迅速,大多数胶质母细胞瘤患者在患病后2年内肿瘤即进展[9],总生存期中位数为11.2个月,手术切除是最主要的治疗手段[10-11]。因此胶质母细胞瘤患者有较大的可能性要面对围术期应激。既往研究主要集中在去甲肾上腺素和前列腺素对胶质母细胞瘤细胞增殖、迁徙和侵袭的影响,对其他激素的研究较少。目前未见应激激素肾上腺素对胶质母细胞瘤进展影响的报道。因此,本研究拟通过MTT实验、细胞划痕实验(wound healing assay)和transwell侵袭实验,探讨肾上腺素对胶质母细胞瘤细胞系U87MG和U251的增殖、迁徙和侵袭的影响。

资料和方法

主要试剂及细胞株肾上腺素(货号:E4642)、普萘洛尔(货号:40543)和transwell实验所需的结晶紫(货号:C0775)购自美国Sigma Aldrich公司;鼠抗人基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)单克隆抗体(货号:ab38898)、鼠抗人GAPDH单克隆抗体、兔抗鼠IgG二抗均购自英国Abcam公司;Corning®胶原Ⅳ®购自美国Corning公司;RPMI-1640细胞培养液及新生牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司;MTT试剂盒购自德国Carl Roth GmbH & Co.;cDNA逆转录及荧光定量PCR采用美国Bio-Rad公司iTaq SYBR Green Supermix试剂盒;人胶质母细胞瘤细胞U87MG和U251均购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。

MTT法检测细胞存活率。U251和U87MG细胞接种在24孔板底部(5×104/孔),加入含有10%FBS的RPMI-1640细胞培养液,培养24 h后,加入不含FBS的RPMI-1640细胞培养液,并用不同浓度的肾上腺素(0.1、1、10、50、100 μmol/L)处理24 h;每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)和完全培养基,37 ℃培养3 h;去除上清液,每孔加入500 μL二甲基亚砜,震荡10 min充分溶解。另设不加入肾上腺素处理的细胞为对照组。最后,使用微孔板分光光度计测定570 nm读数。

细胞划痕实验在6孔板中培养U251和U87MG细胞24 h。24 h后,用细胞划痕实验测定细胞迁徙情况。用200 μL的吸管针尖对每个孔进行划痕。将含有细胞碎片的培养基吸走,用新鲜无血清培养基代替。分别用不同浓度的肾上腺素(0.1、1、10、50 μmol/L)对U251和U87MG细胞进行处理,并保存在5% CO2、37 ℃培养箱中。在0 h和24 h两个时间点使用显微镜评估划痕变化情况,沿每个划痕标记3个随机选择的点,并测量细胞迁徙的水平距离。另设不加入肾上腺素处理的细胞为对照组。

细胞体外侵袭能力测定通过transwell侵袭实验评估细胞侵袭。Corning®BioCoatTM细胞培养板(24孔,8 μm孔径)包被0.53 mg/mL Corning®胶原Ⅳ®,并按照说明书在室温下孵育1 h。将不含FBS的培养基100 μL加入到每孔的上室中,以使上室底部的膜水合,将U251细胞(5 ×105)悬浮于200 μL不含FBS的培养基中,加入到每孔的上室中。下室内加入750 μL含5% FBS的培养基。U251细胞用不同浓度的肾上腺素(0.1、1、10、50 μmol/L)进行处理,并在5% CO2、37 ℃培养箱中保温24 h。吸出上室内培养基,用棉花棒轻轻地擦拭上室底部内侧表面,以机械方式去除上室内侧表面的细胞。迁移至胶原Ⅳ包被的上室下侧面的细胞用0.1%结晶紫染色15 min,在200倍显微镜下,选取5个随机视野,计数侵入细胞,用Image J计算5个视野所得细胞的平均数。另设不加入肾上腺素处理的细胞为对照组。

qRT-PCR以TRIzol-氯仿-异丙醇法提取各细胞株的总RNA,检测含量。按照产品操作说明,以20 μL体系逆转录为cDNA。荧光定量PCR的反应条件为:95 ℃、10 min预变性,95 ℃、15 s,60 ℃、1 min共40个循环,以GAPDH的Ct值作为参照,以2-ΔΔCt计算mRNA倍数变化,引物序列如表1。

表1 qRT-PCR检测使用的肾上腺素能受体和MMP-9引物Tab 1 Primers for adrenergic receptors and MMP-9 detection by qRT-PCR

β-AR:β-adrenergic receptors;MMP:Matrix metalloproteinase.

Western blot检测在直径6 cm的培养皿中培养U87MG细胞株,经0.1、1、10、50 μmol/L肾上腺素处理24 h后,收集细胞上清液和细胞,分别用含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液裂解,提取蛋白质并定量。取40 μL总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,转膜后以8%脱脂奶粉在室温下封闭 1 h,PBST洗涤3次,在1∶1 000浓度的鼠抗人MMP-9单克隆抗体及1∶5 000浓度鼠抗人GAPDH单克隆抗体中4 ℃摇床过夜,PBST洗涤3次,以1∶5 000浓度的兔抗鼠IgG二抗室温摇床孵育1 h,显色。以目的条带与内参条带灰度值的比值计算目的蛋白质水平。

明胶酶谱法检测MMP-9活性U87MG细胞(1×106/mL)接种于细胞培养皿,用不同浓度的肾上腺素处理后收集上清液,将5×上样缓冲液(含0.32% Tris-HCL 6.4 mL,4% SDS 8 mL,16%甘油 3.2 mL,溴酚蓝0.024 g,ddH2O 2.4 mL)添加到上清液中,然后将混合液进行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明胶)电泳分离;电泳后,将凝胶放入 1×酶谱复性缓冲剂(LC2670,美国Life Technology公司)中轻轻震荡30 min;然后将凝胶在显影缓冲液(LC2671,美国Life Technology公司)中37 ℃孵育24 h,使用考马斯亮蓝对凝胶染色。

统计学分析应用Sigmaplot 14.0软件进行统计学分析。对照组和实验组(不同浓度肾上腺素)间采用单因素方差分析,MMP-9、β-AR mRNA表达变化以ΔΔCt作为统计量进行单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

肾上腺素促进U87MG和U251细胞增殖使用qRT-PCR检测β肾上腺素能受体在胶质母细胞瘤细胞系U251和U87MG中的表达情况,结果发现β1、β2肾上腺素能受体mRNA在U251和U87MG中均表达,且在U251细胞中的表达较在U87MG细胞高(图1A)。通过MTT实验检测肾上腺素对U251和U87MG细胞增殖能力的影响,结果表明:50 μmol/L肾上腺素使得胶质母细胞瘤细胞U251的增殖能力较对照组显著升高(P=0.012 1,图1B、C)。

肾上腺素促进U87MG和U251细胞迁徙使用肾上腺素(0.1、1、10、50 μmol/L)处理胶质母细胞瘤细胞U87MG和U25124 h后,U87MG和U251细胞的迁徙能力随着肾上腺素浓度升高逐渐增强;当肾上腺素浓度增加到50 μmol/L时,肾上腺素处理24 h后的U87MG细胞的迁徙能力较0 h显著升高(P=0.001 4),U251细胞的迁徙能力也较0 h显著升高(P=0.002 2);且肾上腺素处理24 h后,U87MG和U251细胞的迁徙能力均较对照组显著升高(P均为0.009 1,图2)。

图1 β-AR能受体的表达情况以及肾上腺素对U251和U87MG细胞增殖的影响
Fig 1 β-AR expression in human glioblastoma U251 and U87MG cells and the effects of epinephrine on U251 and U87MG cell proliferation

A:Representative images of U87MG following treatment with various concentrations of epinephrine for 24 h(×20);B:Distance to be migrated(mm)of U87MG;C:Representative images of U251 following treatment with various concentrations of epinephrine for 24 h(×100);D:Distance to be migrated(mm)of U251.vs.0 h within group(n= 4),(1)P<0.05;vs.control group(n=4),(2)P<0.05.

图2 肾上腺素对U87MG和U251细胞迁徙的影响
Fig 2 Effect of epinephrine on the migration of U87MG and U251 cells

肾上腺素促进U251细胞侵袭使用肾上腺素(0.1、1、10、50 μmol/L)处理24 h后,胶质母细胞瘤细胞U251的侵袭能力随着肾上腺素浓度升高而增加,当肾上腺素浓度增加到50 μmol/L时,U251的迁徙能力显著高于对照组(P=0.009 1,图3A、B)。可见,肾上腺素和U251细胞侵袭能力呈剂量依赖性,绘制剂量-效应曲线,曲线拐点处的肾上腺素浓度为10 μmol/L(图3C)。

A:Representative images of U251 following treatment with various concentrations of epinephrine for 24 h(×200).B:Number of invading glioblastoma cells following treatment with different concentrations of epinephrine for 24 h.C:Dose-effect curve of epinephrine on the invasive ability of U251.vs.control group(n=4),(1)P<0.05.

图3 肾上腺素对U251细胞侵袭能力的影响
Fig 3 Effect of epinephrine on the invasive ability of U251

β-AR阻滞剂抑制肾上腺素对U87MG和U251细胞迁徙和侵袭的促进作用根据剂量-效应曲线,使用10 μmol/L肾上腺素处理U87MG细胞24 h后,细胞的迁徙能力较0 h显著增加(P=0.003 2),且较对照组显著增加(P=0.016 9);但使用10 μmol/L肾上腺素和10 μmol/L β-AR阻滞剂普萘洛尔共同处理U87MG细胞24 h后,U87MG细胞的迁徙能力和对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05,图4A、C)。此外,使用10 μmol/L肾上腺素处理U251细胞24 h后,U251细胞的侵袭能力较对照组显著增加(P=0.017 4),但用10 μmol/L肾上腺素和10 μmol/L β-AR阻滞剂普萘洛尔共同处理U251细胞24 h后,U251细胞的侵袭能力和对照组相比,差异也无统计学意义(P>0.05,图4B、D)。可见,β-AR阻滞剂普萘洛尔能够抑制肾上腺素对U87MG和U251细胞迁徙和侵袭的促进作用。

肾上腺素增加MMP-9的表达和活性使用浓度为0.1、1、10、50 μmol/L的肾上腺素处理胶质母细胞瘤细胞U87MG后,细胞中MMP-9 mRNA的表达随肾上腺素浓度升高而增加,当肾上腺素浓度增加到1 μmol/L时,MMP-9 mRNA的表达较对照组显著增加(P=0.018 9,图5A);使用浓度为0.1、1、10、50 μmol/L的肾上腺素处理胶质母细胞瘤细胞U87MG,细胞上清液中MMP-9蛋白质水平和MMP-9活性都随着肾上腺素浓度升高而增加(图5B、C)。

讨 论

本研究通过MTT实验、细胞划痕实验和细胞体外侵袭能力测定等方法,探索了肾上腺素是否能促进胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁徙和侵袭。肿瘤细胞的增殖决定了肿瘤的生长,而其迁徙和侵袭能力决定了肿瘤的转移。MTT实验、细胞划痕实验和细胞体外侵袭能力测定分别是评估肿瘤细胞增殖能力、迁徙和侵袭能力的常用方法。

有研究表明,手术相关应激会降低患者对微小残留灶疾病(minimal residual disease,MRD)的免疫抵抗,并直接促进MRD生存和发展,两者的综合作用会增加癌症复发的风险,儿茶酚胺和前列腺素可直接作用于MRD[12]。尽管手术切除原发性肿瘤后,细胞介导免疫(cell-mediated immunity,CMI)能够限制或消除MRD,许多患者仍表现为癌症复发,这可能与儿茶酚胺在体内和体外多项实验中表现出抗肿瘤CMI的作用相关[1,5,12]。儿茶酚胺还被证实可能促进乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤的增殖和转移[3]。

A:Representative images of U87MG following treatment with mock,10 μmol/L propranolol,10 μmol/L epinephrine or 10 μmol/L epinephrine plus 10 μmol/L propranolol for 24 h(×40);B:Representative images of U251 following treatment with mock,10 μmol/L propranolol,10 μmol/L epinephrine or 10 μmol/L epinephrine plus 10 μmol/L propranolol for 24 h(×200);C:Distance to be migrated(mm)of U87MG;D:Number of invading U251 cells.E+P:Epinephrine plus propranolol.(1)vs.0 h within group(n=4),P<0.05;(2)vs.control group(n=4),P<0.05.

图4 β-AR阻滞剂普萘洛尔抑制肾上腺素促进U87MG细胞迁徙和U251细胞侵袭的作用
Fig 4 β-AR blocker propranolol can inhibit the effect of epinephrine on the migration of U87MG and the invasion of U251

肾上腺素作为主要的儿茶酚胺类激素,其胞外受体的激活被发现与癌症进展相关。AR分为α和β亚型。β-AR在促进骨髓瘤和肺癌等多种癌细胞增殖[13-14],在前列腺肿瘤组织新生血管生成中起关键作用[5]。而β-AR非选择性阻断剂普萘洛尔能抑制儿茶酚胺介导的肿瘤生长和血管生成[15]。也有研究表明β-AR能受体激动剂并不能促进U87MG细胞增殖[16]。本研究证实β-AR在胶质母细胞瘤细胞U251和U87MG中均有表达,且肾上腺素促进胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁徙和侵袭,而普萘洛尔抑制胶质母细胞瘤细胞的迁徙和侵袭。肾上腺素的这种作用是否通过β-AR途径,是否与其他受体如γ-氨基丁酸B受体(gamma-aminobutyric acid B receptors,GABABR)、α2-AR等存在相互作用,仍需进一步研究。

既往研究表明MMP-9和肿瘤进展相关:靶向IL-17A和MMP-9的双特异性抑制剂可降低乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭和活动能力[17];凝血酶(thrombin)和胶质母细胞瘤的进展相关,而MAPK和PI3K信号通路激活对于凝血酶激活的作用是相反的,MMP-9具有调节以上两种信号通路的作用[18]。MMP-9可能在胶质母细胞瘤细胞的增殖和侵袭中起到了非常重要的作用[18-19]。为了阐明MMP-9是否是肾上腺素促进胶质母细胞瘤细胞U87MG、U251增殖、迁徙和侵袭的相关蛋白,本研究检测了MMP-9 mRNA和细胞上清液中MMP-9蛋白质水平及其活性,结果发现MMP-9随着肾上腺素浓度升高表达增加且活性增强。今后将进一步探索MMP-9在肾上腺素促进胶质母细胞瘤细胞增殖、迁徙和侵袭中的机制。

A:Effect of various concentrations of epinephrine on the mRNA expression levels of MMP-9 in U87MG cells as measured by qRT-PCR.B:Effect of various concentrations of epinephrine on the protein expression levels of MMP-9 in U87MG cells.C:The cell-free supernatants were assayed for MMP-9 activity by gelatin zymography.(1)vs.control group(n=4),P<0.05.

图5 肾上腺素对胶质母细胞瘤细胞U87MG中MMP-9表达和活性的影响
Fig 5 Effect of epinephrine on the expression and activity of MMP-9 in glioblastoma U87MG cells

综上所述,本研究发现肾上腺素能促进胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁徙和侵袭,而阻断β-AR能够拮抗肾上腺素的这种效应,且MMP-9随着肾上腺素浓度升高其表达与活性均增强。肾上腺素促进胶质母细胞瘤细胞增殖、迁徙和侵袭的β-AR亚型及其下游信号通路将是我们下一步的研究目标。