高盐饮食自发性高血压大鼠脑小静脉管壁基质改变观察

薛扬 刘娜 张苗怡 唐杰 付建辉

脑小血管病(cerebral small vessel disease，CSVD)指各种致病因素累及颅内小动脉、小静脉、微动脉、微静脉和毛细血管所导致的一组临床疾病[1]，其中以小动脉硬化型最常见[2]。目前对CSVD发病机制尚未明了。有研究表明，脑室周围静脉胶原沉积与CSVD中的脑白质损害及微梗死有关[3-5]，可能机制包括静脉胶原沉积导致的静脉管腔狭窄、血循环压力增加，血灌注下降，血-脑屏障损害，继而引起慢性缺血、血管源性水肿等[3，6-7]。流行病学资料表明，高血压是小动脉硬化型CSVD最主要的危险因素之一[8]。以往的研究多集中于高血压对小动脉的影响，针对小静脉的病理改变研究较少[9]。本研究拟采用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)模型，探讨高血压对小动脉硬化型CSVD脑小静脉管壁基质表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物：10周龄雄性SHR(高盐饮食SHR组)及雄性Wistar Kyoto(Wistar Kyoto rat，WKY)大鼠(WKY组)，各6只，来源于维通利华实验动物公司，给予SHR 10个月高盐饮食(1%氯化钠饮用水及4%高盐饲料)，给予WKY大鼠10个月正常饮用水及饲料。大鼠均饲养于复旦大学附属华山医院神经病学研究所，恒温22～24℃，恒湿(55±5)%，人工光照明暗各12h。SHR大鼠体质量为360～400g，WKY大鼠体质量为380～440g，大鼠合格证号为SCXK(京)2016-0006。

1.1.2主要仪器及试剂：冰冻切片机(CM3050 S，莱卡，德国)、正置荧光显微镜(BX53，奥林巴斯，日本)；一抗包括兔源抗α-平滑肌细胞肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体(1∶500，Sigma，日本)、小鼠来源抗Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ，COLⅠ)抗体(1∶1 000，Abcam，英国)、小鼠来源抗Ⅳ型胶原蛋白(collagen Ⅳ，COLⅣ)抗体(1∶1 000，Abcam，英国)、小鼠来源抗纤连蛋白抗体(1∶1 000，Abcam，英国)、小鼠来源抗层黏连蛋白(laminin，LN)抗体(1∶1 000，Abcam，英国)等；荧光标记二抗包括Alexa Fluor®488标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000，Invitrogen，美国)、Alexa Fluor®555标记的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000，Invitrogen，美国) 等。

1.2 实验方法

1.2.1组织处理：以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，依次经心脏灌注等渗盐水、4%多聚甲醛，断头取脑，脑组织固定于4℃ 4%多聚甲醛中过夜。一半脑组织用于石蜡切片，一半用于冰冻切片，切片选择层面为前囟前3.0mm(Bregma+3.0mm)，前囟后0.24mm(Bregma-0.24mm)和前囟后3.0mm(Bregma-3.0mm)。参考Bailey等[10]研究方法将脑组织划分为皮质、深部灰质、海马，并进行观察统计分析。

1.2.2苏木素-伊红(HE)染色：取5μm石蜡切片按标准流程进行HE染色[11]，观察小血管形态变化。

1.2.3免疫荧光检测静脉胶原沉积：将荧光显微镜下α-SMA表达连续的视为小动脉，α-SMA不表达或表达不连续的视为小静脉。评估的小静脉直径为20～100μm，除外毛细血管(5μm)及直径<20μm的难以检测的血管。

取冰冻切片，0.25%聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100)破膜15min，5%牛血清白蛋白室温封闭1h，抗α-SMA抗体分别与抗COL Ⅰ 抗体、抗COLⅣ抗体、抗纤连蛋白抗体、抗LN抗体混合后4℃孵育切片过夜，随后相应二抗混合后室温下孵育1h，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染核封片，荧光显微镜下观察。每个层面的每个脑区随机拍摄3～5个视野。使用Image-J软件(V1.48，National Institutes of Health，美国)进行图像分析。以拍摄图片的平均荧光强度量化脑小静脉胶原沉积及各细胞外基质表达的多少。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HE染色血管形态学变化

由于饲养时间较长，高盐饮食SHR组和WKY组均出现2只死亡，实验终点2组动物均为4只。HE染色可见，高盐饮食SHR小动脉血管重构，管壁增厚，内径减小，伴随血管周围间隙增大，符合小动脉硬化型CSVD的病理特点(图1)。

2.2 高盐饮食SHR与WKY大鼠脑小静脉胶原沉积及相关细胞外基质表达情况整体比较

与WKY组比较，高盐饮食SHR组脑小静脉周围有显著增加的COL Ⅰ 沉积及LN表达(均P<0.05；图2，3，表1)；而脑小静脉周围COLⅣ及纤连蛋白表达的差异无统计学意义(均P>0.05；图4，5，表1)。

表1 高盐饮食SHR与WKY大鼠脑小静脉胶原沉积与相关细胞外基质表达水平比较

注：SHR为自发性高血压大鼠，WKY为Wistar Kyoto大鼠；COLⅠ为Ⅰ型胶原蛋白，COLⅣ为Ⅳ型胶原蛋白， LN为层黏连蛋白

2.3 两组不同脑区胶原沉积及细胞外基质表达比较

2.3.1不同脑区脑小静脉COLⅠ沉积比较：与WKY组比较，高盐饮食SHR组脑皮质及深部灰质小静脉COLⅠ沉积显著增加(均P<0.01)，而海马区表达组间差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 高盐饮食SHR与WKY大鼠各脑区脑小静脉Ⅰ型胶原蛋白沉积水平比较

注：SHR为自发性高血压大鼠，WKY为Wistar Kyoto大鼠

2.3.2不同脑区脑小静脉COL Ⅳ 沉积比较：高盐饮食SHR组和WKY组脑皮质、深部灰质及海马的小静脉COL Ⅳ 沉积差异均无统计学意义(均P>0.05，表3)。

表3 高盐饮食SHR与WKY大鼠各脑区脑小静脉Ⅳ型胶原蛋白沉积水平比较

注：SHR为自发性高血压大鼠，WKY为Wistar Kyoto大鼠

2.3.3不同脑区脑小静脉纤连蛋白表达水平比较：与WKY组比较，高盐饮食SHR组各脑区的脑小静脉纤连蛋白沉积差异均无统计学意义(均P>0.05，表4 )

2.3.4不同脑区脑小静脉LN表达水平比较：与WKY组比较，高盐饮食SHR深部灰质小静脉LN表达显著增加(P=0.002)，皮质和海马区小静脉LN表达差异均无统计学意义(均P>0.05，表5)。

表4 高盐饮食SHR与WKY大鼠各脑区脑小静脉纤连蛋白表达水平比较

注：SHR为自发性高血压大鼠，WKY为Wistar Kyoto大鼠

表5 高盐饮食SHR与WKY大鼠各脑区脑小静脉层黏连蛋白表达水平比较

注：SHR为自发性高血压大鼠，WKY为Wistar Kyoto大鼠

3 讨论

在以高血压为主要危险因素的小动脉硬化性CSVD中，脑小动脉存在管壁增厚、管壁基质增生、血管内径减小等重构变化，高血压在小动脉重构中起重要作用[12]。为模拟长期慢性高血压并加剧SHR大鼠血管重构改变，本实验对SHR大鼠给予了长达10个月的高盐饮食饲养，发现配合高盐饮食的高血压大鼠不仅表现小动脉重构，其脑小静脉管壁基质也明显增生。

脑静脉血管壁基质沉积增加最早见于Moody等[3]的报道，他们通过对22例不同年龄死者的尸检，发现65%的60岁以上患者存在脑室周围静脉胶原沉积，因而提出“脑室周围静脉胶原病”一词。Brown等[5]研究发现，人脑室周围静脉胶原沉积的主要成分是COLⅠ和COLⅢ，而Lin等[4]在双肾双夹合并双侧颈动脉狭窄大鼠中发现，脑小静脉胶原沉积以COLⅠ和COLⅣ为主。本研究结果表明，高盐饮食SHR大鼠脑小静脉血管壁COL Ⅰ 较WKY组明显增生，COL Ⅳ与WKY组间差异无统计学意义，与Lin等[4]报道基本一致。高血压导致的小动脉血管壁基质增生，不仅表现在胶原增生，还伴随LN及纤连蛋白等其他血管壁基质的改变，并且有报道指出，LN及纤连蛋白可能在血管壁胶原持续表达中起到稳定作用[13-14]。因此，本研究同时还检测了脑小静脉壁LN及纤连蛋白表达情况，其中高盐饮食SHR大鼠脑小静脉LN明显增生。有研究提示，LN可能参与高血压带来的血流剪切力变化对内皮细胞的影响，高盐饮食SHR大鼠脑小静脉LN增生可能进一步提示，血流动力学变化在脑小静脉基质增生中可能起到重要作用[15]。

目前对于脑静脉血管壁基质增生的报道多见于脑室周白质脑静脉，本研究结果表明，高盐饮食SHR大鼠深部灰质亦存在明显的COLⅠ及LN增生，提示长期慢性高血压下不仅白质小静脉受累，脑灰质小静脉也存在血管壁基质增生。

值得注意的是，有报道指出，啮齿类动物皮质小静脉数目远多于小动脉[16]，而人脑皮质小静脉数目远少于小动脉，加之在病理研究中，对于小动脉及小静脉的区分鉴别方法尚不成熟[4]，可能在一定程度上减少了对人脑灰质小静脉血管壁基质增生的报道。同时有研究者推测，由于在人脑皮质中单支小静脉负责引流多支小动脉，因此皮质小静脉受累时可能同时波及多支小动脉供应脑区[16]，因此皮质小静脉形态及功能可能是脑血管病中一道重要关口。既往研究显示，长期高血压导致小动脉硬化过程中，小动脉α-SMA表达下降[4]。本研究中高盐饮食SHR大鼠为10月龄，其小动脉α-SMA表达下降可能更明显，此外， 我们在本实验中所取层面白质区占解剖区域较小，因此未能捕捉到脑白质区α-SMA明显表达以鉴别小动脉及小静脉，后期未选取白质区观察小静脉管壁基质改变。目前已有研究提示，白质静脉病变可能在皮质下微梗死中起重要作用[17]，而人脑灰质小静脉病变情况及其是否与皮质微梗死有关仍需进一步研究。

小静脉血管壁基质增生的机制可能与上游小动脉病变后低灌注引起的氧化应激相关[18]，也可能与上游小动脉硬化导致下游小静脉血流动力学改变进而引起的生物力学反应有关[19]，而小静脉血管壁基质增生导致的引流不畅进一步加重动脉病变，形成恶性循环。因此未来研究需关注于脑小静脉血管壁基质增生的机制及其是否参与CSVD发病机制中。