SH3BGRL3基因过表达对NB4细胞增殖及分化的影响

宋君红，沈树红

（上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心血液科，上海 200127）

SH3 域结合谷氨酸丰富蛋白样蛋白3 （SH3 domain binding glutamic acid-rich protein like 3，SH3BGRL3） 是硫氧还蛋白超基因家族的成员，基因定位于1p34.3-p35，编码93个氨基酸。它编码的蛋白和大肠杆菌的谷氧还蛋白 （glutaredoxin，GRX） 1很相似，是一类小型氧化还原酶。但SH3BGRL3缺乏GRX酶2个半胱氨酸残基组成的CXXC活性结构域，所以缺乏GRX酶活性。另外有研究［1］认为SH3BGRL3蛋白可能参与抑制肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 介导的细胞凋亡，所以又被叫做TNF抑制蛋白 （TIP-B1）。近期有研究［2］发现SH3BGRL3也是一种新的表皮生长因子受体结合伙伴，但对其确切功能知之甚少。本课题组前期研究［3］发现，SH3BGRL3基因及蛋白在全反式维甲酸 （all-trans retinoic acid，ATRA） 诱导急性早幼粒细胞白血病 （acute promyelocytic leukemia，APL） 细胞株NB4分化过程中明显上调，而SH3BGRL3在急性髓细胞白血病细胞株HL60中也可被ATRA诱导上调。根据以上结果，推测SH3BGRL3基因高表达与ATRA诱导NB4细胞分化成熟有关。为进一步探讨NB4细胞分化与SH3BGRL3基因表达之间的关系，本研究应用含SH3BGRL3基因的慢病毒质粒感染NB4细胞，使NB4细胞稳定过表达SH3BGRL3基因，观察过表达SH3BGRL3后NB4细胞在ATRA作用下分化行为的改变。

1 材料与方法

1.1 材料

慢病毒包装系统由pLV-CXIH、psPAX2和pMD2.G这3个质粒构成，其中pLV-CXIH为过表达慢病毒转移载体，而psPAX2和pMD2.G则含有病毒包装所必须的其他元件。大肠杆菌感受态DH5 α为本实验室保存；携带SH3BGRL3基因的质粒pSG5-M-SH3BGRL3-FLAG由本课题组前期构建完成；APL细胞株NB4细胞及293T细胞均为本实验室保存。Taq DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA 连接酶、EcoRⅠ、BamHⅠ限制性内切酶等均购自大连宝生物工程有限公司；凝胶回收试剂盒Gel Extraction Kit购自美国Omega Bio-Tek公司；磷酸钙转染试剂盒购自日本TaKaRa公司；DMEM培养基购买自美国Invitrogene公司；质粒小抽试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；CD11b、CD54、SH3BGRL3抗体购自美国Cell Signaling公司；CCK-8购于日本同仁化学研究所。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒表达载体pLV-CXIH-SH3BGRL3的构建与鉴定：以本实验室前期构建好的含有目的基因的克隆质粒pSG5-M-SH3BGRL3-FLAG为模板，用高保真酶体系扩增目的基因。PCR产物切胶纯化回收，片段长度280 bp。回收产物用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，同时双酶切慢病毒载体质粒pLV-CXIH，并切胶纯化回收，片段长度8 060 bp。2种胶回收产物用T4连接酶连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH感受态细胞，挑取阳性克隆，于LB培养液中扩增并提取质粒，送中国Invitrogene公司测序，确定插入序列正确。

1.2.2 慢病毒质粒包装：取对数生长期293T细胞，2×106/皿，种于10 cm平皿中，待细胞生长至70%时转染慢病毒质粒。转染前1 h更换新鲜培养基。转染体系如下：pLV-CXIH-SH3BGRL3 15 µg、psPAX2 10 µg、pMD2.G 5 µg，溶解于TE缓冲液，浓度为0.4～1 µg/µL。转染操作参照磷酸钙转染试剂盒说明书。16 h后更换培养液，换液后48 h收集病毒上清，于冰上短期保存。空质粒转染同上。

1.2.3 慢病毒转染NB4细胞：对数生长期的NB4细胞以2×105/mL的密度接种于6孔板中，分别加入6µg/mL的聚凝胺和1 mL包含有慢病毒载体的培养上清，900 g离心2 h，然后去除上清，重悬于1 mL完全培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱内孵育。每天重复以上操作1次，转染3～4 d后加Hygromycin B筛选。置于培养瓶中传代培养。

1.2.4 Western blotting鉴定：提取转染SH3BGRL3（NB4-SH3） 和转染病毒空载的 （NB4-blank） 的2组NB4细胞及未经转染的NB4细胞蛋白作为空白对照，用BCA试剂盒进行蛋白定量，上样量20 µg，湿式转膜，鼠抗人SH3BGRL3单克隆抗体检测目的基因转染情况。

1.2.5 采用CCK-8检测过表达SH3BGRL3对NB4细胞增殖的影响：将处于对数生长期NB4-blank、NB4-SH3细胞接种于96孔培养板内，密度为 （2.0～2.5） ×104/孔，分为给药组和不给药组。给药组加入ATRA （终浓度1 µmol/L），孵育12、24、36、48、60及72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 µL孵育4～5 h，采用酶联免疫检测仪测量450 nm处各孔的吸光度值。放入培养箱中孵育到上述各相应时间段。

1.2.6 过表达SH3BGRL3对NB4细胞分化的影响：将NB4-blank、NB4-SH3细胞以2×105/mL的密度接种于6孔板内，分为给药组和不给药组。给药组加入ATRA （终浓度1 µmol/L）。培养72 h后，流式细胞仪检测各组细胞CD11b、CD54的表达情况，并用瑞士-吉姆萨染色观察各组细胞形态学变化。

1.3 统计学分析

所有统计分析采用SPSS 20.0软件进行。计量资料采用±s表示，多组间比较采用方差分析，2组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 构建SH3BGRL3过表达载体转染NB4细胞后Western blotting检测结果

SH3BGRL3慢病毒载体转染NB4细胞后，Western blotting结果显示，转染SH3BGRL3基因后NB4-SH3细胞SH3BGRL3蛋白的表达明显增高，见图1。

图1 构建稳定过表达SH3BGRL3的NB4细胞株Fig.1 Establishment of NB4 cells with stable overexpression of SH3BGRL3

2.2 SH3BGRL3基因对NB4细胞增殖的影响

不给药状态下NB4-SH3组细胞的增殖较NB4-blank组降低，但差异无统计学意义；而ATRA处理后，NB4-SH3+ATRA组细胞的增殖较NB4-blank+ATRA组明显降低，差异有统计学意义 （P < 0.05），见图2。

2.3 NB4细胞转染SH3BGRL3后对细胞分化的影响

图2 过表达SH3BGRL3基因抑制NB4细胞增殖Fig.2 NB4 cell proliferation was significantly inhibited by overexpression of SH3BGRL3

NB4-SH3和NB4-blank细胞经ATRA处理48 h后，NB4-SH3细胞较对照NB4-blank细胞形态上趋于成熟 （图3）。流式细胞术检测发现，ATRA处理72 h后，NB4-SH3+ATRA组细胞CD11b、CD54的表达较NB4-blank+ATRA组增加，其中CD54的差异有统计学意义 （P < 0.05） ，见图4。

图3 NB4细胞过表达SH3BGRL3后经ATRA处理48 h后的形态变化 ×1 000Fig.3 Morphological changes of NB4-SH3 and NB4-blank cells treated with ATRA for 48 h ×1 000

图4 NB4-SH3和NB4-blank细胞经ATRA处理72 h后CD11b和CD54阳性率的比较Fig.4 Changes in CD11b and CD54 expression in NB4-blank and NB4-SH3 cells treated with ATRA for 72 h

3 讨论

APL约占所有急性非淋巴细胞白血病病例的10%左右，95%以上的APL患者的白血病细胞中均含有特异的染色体易位t （15；17） （q22；q12），形成融合基因PML-RAR α与RAR α-PML，通过与维甲酸X受体 （retinoic acid X receptor，RXR） 及其他RAR α辅因子形成多聚复合体，竞争性抑制正常RAR α基因的转录活性，进而阻遏髓系分化必需的一些基因的转录，并抑制细胞凋亡，造成骨髓中大量未成熟的早幼粒细胞增生［4-5］。

ATRA在药理浓度 （10-6～10-7mol/L） 下能使PML-RAR α与核受体共抑制因子N-CoR解离，释放转录抑制作用，促进维甲酸反应基因包括多种癌基因、转录因子和细胞因子等靶基因的转录。研究［6］发现，APL细胞受维甲酸调变的基因多达169种，包括100种上调基因及69种下调基因。通过庞大的基因调控网络减少APL细胞增殖，维持细胞的活性，调节蛋白质功能，最终促进粒细胞分化成熟。

在ATRA诱导APL细胞株NB4分化成熟的过程中，SH3BGRL3是早期调变的基因。先期的研究发现，其mRNA水平在ATRA处理12 h后达到峰值，蛋白水平在24 h达到峰值。SH3BGRL3是一种胞质蛋白，在NB4及多种正常组织中都有表达。目前对其功能知之甚少。一般认为，ATRA诱导NB4细胞12 h内发生调变的基因对启动NB4细胞分化作用更重要。而SH3BGRL3基因调变与NB4细胞分化趋势一致，所以本研究通过NB4细胞过表达SH3BGRL3基因，研究NB4-SH3的功能变化，以了解SH3BGRL3基因在NB4细胞增殖及分化成熟中的作用。

本研究发现，在细胞增殖方面NB4-SH3细胞增殖较NB4细胞降低，ATRA处理后这种增殖抑制效果更明显。通过细胞周期分析发现，SH3BGRL3增加周期的阻滞功能。细胞形态学研究结果发现，过表达SH3BGRL3后NB4细胞形态趋于成熟，通过细胞流式术检测到NB4细胞表面成熟粒细胞免疫标记CD11b表达增加，也证实了这一点。

NB4细胞经ATRA诱导成熟后引起一系列细胞表 面 抗 原 变 化，包 括CD11c、CD54、CD11a、CD14、CD11b、CD53、CD65、CD138等，这些抗原的变化可以作为APL治疗性抗体的选择。本研究发现，NB4-SH3细胞较对照NB4细胞CD54、CD11b的表达无明显增高，但经ATRA处理后，CD54、CD11b的表达增加。所以认为SH3BGRL3的表达能促进ATRA诱导NB4细胞成熟，考虑SH3BGRL3通过作用于其他伙伴基因共同促进ATRA诱导的NB4细胞分化成熟。ATRA治疗过程中约30%的APL患者可能出现维甲酸综合征，其原因为诱导分化后的细胞通过改变黏附分子和细胞趋化因子引起细胞及邻近细胞的相互作用导致［7］。CD54分子 （ICAM-1） 在APL细胞表达低下，而ATRA和三氧化二砷能明显诱导APL细胞及肺脏血管上皮CD54的表达。考虑CD54可能参与介导了肿瘤与基质的黏附，从而与维甲酸综合征的发生有关［8］。

造血细胞的分化需要启动不同转录因子的表达，调节编码细胞膜蛋白及细胞因子等基因的活性，影响细胞的生长、增殖、分化和凋亡，并伴随细胞膜蛋白及细胞因子的变化，而这些蛋白及细胞因子的表达提供了有关预后的信息。研究发现，APL细胞中如果伴有TNF-α、白细胞介素-1等能提高ATRA对APL患者的治疗敏感性，有利于APL细胞的分化成熟。TNF-α能下调细胞的数量，并且参与细胞的生长、增殖及存活。有研究［1］发现，SH3BGRL3能激活核因子-κ B信号通路，抑制TNF-α介导的成纤维细胞的凋亡。而在ATRA诱导NB4细胞分化成熟的过程中C-fos、C-jun表达增高，与核因子-κ B相关基因开启有关。所以SH3BGRL3是否通过抑制TNF-α信号通路介导的细胞凋亡，促进或增强ATRA诱导的NB4细胞的分化成熟，有待进一步研究。