17 β-雌二醇通过GPR30和PI3K/Akt信号通路影响ATDC5软骨细胞线粒体自噬的机制

成冬，郭磊，姜天龙，周仁义，刘文博，罗鹏，梅润宏，杨旭浩

（中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳 110001）

线粒体自噬是一种选择性自噬，通过自噬体—溶酶体系统去除损伤和功能障碍的线粒体，确保细胞内线粒体功能稳定和细胞存活。软骨细胞是关节软骨的唯一细胞类型，线粒体功能影响软骨细胞存活，因此线粒体自噬与骨性关节炎 （osteoarthritis，OA） 的发病紧密相关［1］。最近发现17 β-雌二醇不仅与氧化应激、炎症反应和细胞凋亡有关，还与自噬相关。已有研究［2］证明，在Raw 264.7细胞中17 β-雌二醇可以通过激活PI3K/Akt信号转导通路降低氧化应激和炎症反应。17 β-雌二醇可以通过ER-ERK-mTOR途径促进成骨细胞自噬，保护成骨细胞免受无血清诱导的细胞凋亡［3］。G蛋白耦联雌激素受体30 （G-protein coupled estrogen receptor-30，GPR30） 是一种7次跨膜G蛋白耦联雌激素受体，能介导快速的细胞反应。细胞自噬中，新合成的微管相关蛋白1轻链3 （microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3） 经剪切修饰变成胞浆蛋白LC3-Ⅰ，之后转变为LC3-Ⅱ，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，参与自噬体的伸展扩张。TOM20是线粒体外膜复合体转位亚基，参与线粒体前体蛋白转运，被认为是线粒体自噬的潜在标志物［4］。热休克蛋白60 （heat shock protein 60，Hsp60） 主要定位于线粒体内，可通过催化过氧化氢还原成水，保护线粒体免于活性氧 （reactive oxygen species，ROS） 诱导的损伤。新的证据表明，雌激素可通过GPR30对脊髓损伤进行保护；可通过改变PI3K/Akt-mTOR信号通路调节细胞自噬，从而降低脊髓损伤后的损伤程度［5］。本研究拟探讨17 β-雌二醇是否通过抑制线粒体自噬保护ATDC5软骨细胞，以及17 β-雌二醇是否通过GPR30/PI3K/Akt途径调节线粒体自噬。

1 材料与方法

1.1 试剂和抗体

17 β-雌二醇购自美国Sigma-Aldrich公司。含有L-谷氨酰胺和HEPES以及胎牛血清的DMEM/F12购自美国Logan公司。选择性GPR30拮抗剂 （G15） 购自美国Tocris Bioscience公司。P38抑制剂、JNK抑制剂、PI3K抑制剂、抗-GPR30 （sc-48525-R，多克隆，WB 1∶200，IF 1∶50） 、抗Lamp2 （sc-8100，多克隆，IF 1∶50） 、抗TOM20 （sc-11415，多克隆，WB 1∶200，IF 1∶50） 、抗-LC3 （sc-376404，单克隆，WB 1∶100） 和抗Hsp60 （sc-1052，多克隆，WB 1∶200） 均购自美国Santa Cruz Biotechnology公 司。Anti-Total/phosphor-Akt购自美国Abcam公司。具有alexa fluor 555标记的驴抗兔IgG （P0179） 的免疫荧光染色试剂盒购自中国江苏Beyotime Biotechnology公司。IFKine®绿色结合驴抗山羊IgG （A24231） 购自美国Abbkine公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：购买小鼠软骨原代细胞系ATDC5（中国南京Kebai公司） 。用含有5%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养ATDC5细胞。将细胞在37 ℃含有5%CO2的湿化培养箱中培养。每2 d更换1次培养基。在无血清培养基中培养24 h后，将细胞用不同浓度的17 β-雌二醇（ 0 mol/L，10-9mol/L，10-8mol/L和10-7mol/L，含或不含15 μ mol/L的G15或20 μ mol/L的LY294002） 处理24 h。

1.2.2 免疫荧光染色（ immunofluorescence staining，IF） 分析：将ATDC5软骨细胞在24孔板中培养孵化后，用4%多聚甲醛固定并加入0.1 mol/L磷酸盐（ pH7.3） 缓冲30 min。标本固定后，用PBS洗涤10 min。用0.1%TritonX-100处理细胞30 min以透化细胞膜，再用PBS洗涤10 min。用含有5%牛血清白蛋白的TBST封闭30 min，加入特异性一抗Lamp2抗体（ 1∶50），TOM20抗体（ 1∶50） 或GPR30抗体（ 1∶50），4 ℃过夜。用PBS洗涤细胞10 min，并加入二抗IgG（ A24231，1∶1 000） 和IgG（ P0179，1∶1 000） 反应30 min。DAPI染色5 min后，PBS洗涤15 min。通过Olympus FV1000共焦激光扫描显微镜观察，峰值发射波长在518 nm（ 绿色） 和565 nm（ 红色） 。

1.2.3 Western blotting：用PBS洗涤ATDC5软骨细胞，通过加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（ 中国Beyotime公司） 和磷酸酶抑制剂（ 中国KeyGen公司） 的放射性免疫沉淀测定缓冲液（ 中国Beyotime公司） 获得总蛋白质；用BCA蛋白质测定试剂盒（ 中国Beyotime公司）测定其浓度。采用SDS-PAGE分离样品，转移蛋白至PVDF，70 V处理1.5 h。为了阻断非特异性结合，室温下将PVDF膜在脱水脱脂牛乳中处理120 min，用含Tween 20的TBS洗涤3次，持续30 min。加入一抗，在4℃下孵育过夜。TBST洗涤30 min，与辣根过氧化物酶缀合的抗物二抗体室温下孵育2 h。TBST洗膜3次共30 min，采用BeyoECL plus试剂盒使蛋白质显像。

1.2.4 细胞活力和增殖检测：将ATDC5软骨细胞接种于96孔板（ 2×103/孔），培养24 h。将细胞转移至不含血清的DMEM/F12培养基中（ 含有1 7β-雌二醇10-7mol/L），37 ℃孵育24 h后，加入10 μ L MTT试剂（ 5 mg/mL），37 ℃孵育4 h。除去培养基，用100 μ L二甲基亚砜溶去甲臜晶体。所有实验均重复3次。参考570 nm波长，使用酶标仪（ 光谱最大加384微板读数器，德国Ismaning公司） 测量光密度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 17 β-雌二醇增强ATDC5软骨细胞中GPR30的表达

Western blotting分析 （图1A、1B） 和IF染色 （图1C） 结果显示，GPR30在ATDC5中有表达。用不同浓度的17 β-雌二醇 （0，10-9，10-8和10-7mol/L，含或不含15 μ mol/L的G15） 处理ATDC5软骨细胞24 h，结果显示17 β-雌二醇以剂量依赖性方式提高GPR30的表达水平，浓度为10-7mol/L时GPR30表达水平最高 （P ＜0.05） （图1A、1B） 。此外，Western blotting结果还显示GPR30表达水平以时间依赖性方式递增 （图1A） 。IF染色显示，17 β-雌二醇提高了GPR30在细胞膜和细胞质中的表达 （P ＜ 0.05） （图1C） 。

图1 17 β-雌二醇增强ATDC5软骨细胞内GPR30的表达Fig.1 17 β-estradiol can stimulate the activation of GPR30 expression in ATDC5 chondrocytes

2.2 17 β-雌 二 醇 通 过 调 节ATDC5细 胞 中LC3、TOM20和Hsp60的磷酸化抑制线粒体自噬

为了解17 β-雌二醇对线粒体自噬蛋白质活性的影响，本研究检测了LC3、TOM20和Hsp60的表达。与对照组相比，用17 β-雌二醇处理的细胞LC3-Ⅱ的表达水平显著降低；而17 β-雌二醇和G15或PI3K抑制剂对细胞内LC3-Ⅱ的表达没有影响 （图2） 。与对照组相比，用17 β-雌二醇处理的细胞内TO M20和Hsp60的表达水平更高；而G15或PI3K抑制剂对TOM20和Hsp60的表达没有影响 （图3） 。

2.3 17 β-雌 二 醇 通 过GPR30/PI3K/Akt途 径 保 护ATDC5软骨细胞

图2 17 β-雌二醇通过ATDC5细胞中GPR30/PI3K/Akt通路调控LC3、TOM20和Hsp60的表达Fig.2 17 β-estradiol regulates the expression of LC3，TOM20，and Hsp60 in mitophagy through the GPR30/PI3K/Akt pathway in ATDC5 cells

图3 17 β-雌二醇通过ATDC5细胞中GPR30/PI3K/Akt通路调节线粒体自噬。Fig.3 17 β-estradiol regulates mitophagy through the GPR30/PI3K/Akt pathway in ATDC5 cells

Western blotting结果显示，用17 β-雌二醇处理的细胞Akt磷酸化水平升高，总Akt表达水平保持不变。当用G15 （15 μ mol/L） 或PI3K抑制剂 （20 μ mol/L） 处理细胞时结果相反 （图2），表明ATDC5细胞中17 β-雌二醇 （10-7mol/L） 可以通过GPR30激活PI3K/Akt途径。此外，mTOR磷酸化 （p-mTOR） 的抑制程度可作为自噬途径活化的指标。结果显示，17 β-雌二醇 （10-7mol/L） 可提高ATDC5细胞内p-mTOR的水平，而在用G15或mTORi （10-7mol/L） 处理的细胞中则结果相反（图3），表明ATDC5细胞中17 β-雌二醇可通过GPR30激活p-mTOR，抑制线粒体自噬。

此外，17 β-雌二醇对ATDC5细胞的作用可以被GPR30抑制剂、PI3K抑制剂或mTORi消除 （图2、3），表明17 β-雌二醇通过GPR30/PI3K/Akt途径抑制线粒体自噬。

为了确定雌二醇是否通过GPR30/JNK或GPR30/P38途径保护ATDC5软骨细胞，用添加或不添加JNK抑制剂 （10 μ mol/L） 、P38抑制剂 （10 μ mol/L）或G15 （15 μ mol/L） 或混合2种抑制剂的17 β-雌二醇（10-7mol/L） 处理无血清培养的ATDC5细胞24 h。结果表明，用17 β-雌二醇处理的ATDC5细胞中，P38和JNK没有磷酸化改变；用G15、P38抑制剂或JNK抑制剂处理细胞，也未观察到相反的结果 （图3） 。MTT结果显示，17 β-雌二醇处理的ATDC5软骨细胞的增殖和活力显著高于对照组 （P ＜ 0.05），且ATDC5软骨细胞的增殖和活力可被G15和PI3K抑制剂减弱 （图4） 。提示17 β-雌二醇可通过GPR30/PI3K/Akt途径促进无血清培养的ATDC5软骨细胞的增殖和活力。

图4 17 β-雌二醇通过GPR30 PI3K/Akt通路调节ATDC5软骨细胞增殖与活力Fig.4 17 β-estradiol can protect ATDC5 chondrocytes via the GPR30/PI3K/Akt pathway

3 讨论

研究发现，用雌二醇处理的ATDC5细胞中含有较少的自噬体，经雌二醇处理的ATDC细胞中TOM20阳性颗粒与Lamp2［6］减少，表明线粒体自噬在ATDC5细胞中可被17 β-雌二醇抑制。然而，雌激素保护软骨细胞免受损害的分子机制目前尚未明确。本研究结果显示，用17 β-雌二醇处理的ATDC5细胞增殖和活力显著高于对照组，证实了17 β-雌二醇对软骨细胞的保护作用。

氧化应激可导致线粒体损伤，如果损伤超过线粒体内膜的膜电位，则功能失调的线粒体将通过自噬途径被去除，也称线粒体自噬。细胞虽可通过线粒体自噬途径去除氧化应激损伤的线粒体，保护细胞免于凋亡，但过量的线粒体自噬将导致大量重要细胞成分减少，从而导致细胞死亡［7］。已有研究表明，自噬可能是通过消除生长促进分子和细胞器，如蛋白质p62，降低细胞的生长速率。当p62耗竭或去除时，mTOR不能被激活，导致细胞生长受限［8］。针对过量的自噬，线粒体能够采用其他机制，如融合/裂变周期以及线粒体解折叠蛋白反应的胞内质控机制，来修复或去除受损的线粒体，以确保线粒体维持其正常功能［9］。细胞还可通过增加线粒体伴侣蛋白 （Hsp60，Hsp70） 和蛋白酶表达激活线粒体解折叠蛋白反应途径，以保护线粒体免于功能障碍。血清饥饿培养的HeLa细胞可诱导线粒体自噬，随着LC3-Ⅱ表达的增加可降低TOM20的表达［10］。本研究也发现，LC3-Ⅱ的表达水平下降，而Hsp60和TOM20的表达水平上升。因此，17 β-雌二醇可能通过抑制线粒体自噬来保护ATDC5软骨细胞，并有助于修复线粒体损伤。

本研究结果发现，17 β-雌二醇可通过GPR30和PI3K/Akt-mTOR信号通路抑制ATDC5细胞线粒体自噬，表明PI3K/Akt-mTOR信号通路可作为治疗OA的新途径。已有研究［11-12］表明，17 β-雌二醇可通过结合心肌细胞和癌细胞内的GPR30受体执行其生理功能。本研究发现，GPR30在ATDC5软骨细胞中也有表达，17 β-雌二醇 （0，10-9，10-8和10-7mol/L） 以剂量依赖性方式增加GPR30的表达水平，提示17 β-雌二醇可能通过作用于GPR30发挥其生理调节功能。Western blotting结果显示，17 β-雌二醇对ATDC5软骨细胞GPR30表达水平的诱导具有时间依赖性，此诱导作用可被GPR30拮抗剂阻断，导致LC3-Ⅱ高表达，TOM20和Hsp60低表达。提示17 β-雌二醇可能是通过GPR30抑制线粒体自噬。

本研究结果显示，用17 β-雌二醇培养ATDC5软骨细胞24 h后，细胞内Akt磷酸化水平增加，总Akt表达水平保持不变。据文献报道，mTOR受PI3K正调控，是自噬的负调控因子。与对照组相比，用17 β-雌二醇处理的ATDC5细胞中p-mTOR的表达水平显著升高。17 β-雌二醇对ATDC5细胞的作用可被GPR30抑制剂、PI3K抑制剂或mTORi消除，表明17 β-雌二醇通过GPR30/PI3K/Akt途径抑制线粒体自噬。已有研究［13］发现，17 β-雌二醇通过PI3K/Akt信号通路抑制肿瘤坏死因子-α诱导人髓核细胞凋亡。17 β-雌二醇还可以通过PI3K/Akt/caspase-3途径降低大鼠髓核细胞的凋亡发生率［3-5］。此外，PI3K/Akt信号转导与线粒体氧化应激负相关，而PI3K/Akt信号转导的激活能减少ROS的产生［14-15］。本研究中，为了验证17 β-雌二醇是否也可以通过JNK和P38调节线粒体自噬，用P38抑制剂和JNK抑制剂预处理细胞30 min，结果发现处理前后细胞内p-P38和P-JNK的水平无统计学差异。表明17 β-雌二醇不能通过JNK或P38信号传导途径调控线粒体自噬。