乳腺癌中DEAH盒解旋酶16的表达及临床意义

庄莹，张淑红，樊伟平，赵小芳，孙海燕，刘爽 ，张虎

（1. 江苏医药职业学院基础医学部生化教研室，江苏 盐城 224005；2. 佳木斯大学基础医学院生物教研室，黑龙江 佳木斯 154007；3. 江苏医药职业学院护理学院内科护理教研室，江苏 盐城 224005）

乳腺癌是较为常见的女性恶性肿瘤之一。据最新统计，中国每年乳腺癌发病数占世界总数的12.2%，每年因乳腺癌死亡的病例数占世界总数的9.6%，且发病率和新发病例数目前仍在增加［1］。随着生活水平的提高，人们对预后的关注度也在提升。DEAH盒解旋酶16 （DEAH-box helicase 16，DHX16）是一种蛋白质编码基因，与主要组织相容性抗原同样定位于染色体6p21.3，此区域与肿瘤的发生和自身免疫疾病相关［2］。但是，DHX16在乳腺癌发生和发展过程中的研究未见报道。本研究利用多组学高通量数据，分析DHX16在乳腺癌中的表达情况及表达变化相关因素，为乳腺癌临床研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 数据来源

通 过 癌 症 基 因 组 学 分 析 网 站cBioPortal［3-4］（http：//www.cbioportal.org） 、癌症芯片数据库UALCAN［5］（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html） 、癌症多组学数据平台LinkedOmics［6］（http：//www.linkedomics.org），分析乳腺癌组织中DHX16基因表达变化、基因表达变化相关因素及其临床意义。

1.2 数据分析方法

1.2.1 mRNA水平变化与基因甲基化相关性的研究方法：登录cBioPortal首页，选择实时更新的TCGA浸润性乳腺癌患者数据集，分析 DHX16 基因突变、拷贝数变化、mRNA水平变化以及 DHX16 高表达与患者预后的关系。分析 DHX16 mRNA水平变化时，选择RNA测序，并选择默认阈值“DHX16：EXP≥2 or DHX16：EXP≤-2”下载分析结果；进一步使用该网站分析 DHX16 高表达与患者预后的关系，mRNA水平变化与DHX16基因甲基化的相关性。

1.2.2 基因表达变化与癌症分型相关性的研究方法：登录TCGA门户网站UALCAN首页，点击“Analysis”，输入基因名称“DHX16”，选择TCGA dataset“Breast invasive carcinoma”，检索，点击“Expression”，记录结果。利用GraphPad 6.0软件作图，统计方法为t检验，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

1.2.3 mRNA水平变化与基因拷贝数变化相关性的研究方法：登录LinkedOmics首页，癌症组选择“TCGA_BRCA”，检索数据集选择“HiSeq RNA”，输入目标基因“DHX16”，目标数据集选择“Clinical”，统计方法选择“Non-parametric T test”，提交，在分析结果中选择“P ＜ 0.05”的临床相关指标进行分析；使用该网站分析DHX16 mRNA水平变化与DHX16基因拷贝数变化相关性。

1.3 统计学分析

采用GraphPad软件进行统计学处理，计量资料的比较采用t检验，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DHX16在乳腺癌患者中表达的变化及其与预后的关系

对1 093例乳腺癌患者样本数据进行分析发现，12%的患者DHX16 mRNA表达上调 （图1A） ；16%的患者DHX16基因发生改变，包括基因扩增、缺失、错义突变、mRNA下调或上调 （图1B） ；且DHX16高表达不利于乳腺癌预后 （P = 0.004） （图1C） ；浸润性乳腺癌中DHX16基因表达较正常乳腺组织显著增加（P ＜ 0.001） （图1D） 。

图1 DHX16在乳腺癌患者中表达的变化及其与预后的关系Fig.1 Changes in DHX16 expression in breast cancer patients and its relationship with prognosis

2.2 乳腺癌患者中DHX16基因表达变化与临床指标的相关性

乳腺癌患者中DHX16基因表达在不同PAM50分子亚型、种族、病理分期、M分期、T分期中表达有差异 （均P ＜ 0.05） 。见图2。

2.3 DHX16基因拷贝数变化及甲基化影响其表达

图2 DHX16基因表达与各临床指标的关系Fig.2 Correlation between DHX16 gene expression and clinical findings

结果显示，DHX16拷贝数变化和DHX16 mRNA水平呈正相关 （r = 0.56，P ＜ 0.05） （图3A） ；DHX16基因甲基化水平和DHX16 mRNA水平呈负相关 （r =-0.32，P ＜ 0.05） （图3B） 。

图3 乳腺癌患者DHX16基因甲基化和拷贝数变化对mRNA水平的影响Fig.3 Effect of DNA methylation and copy number variation on DHX16 mRNA levels in breast cancer

3 讨论

乳腺癌是中国女性患病率最高的恶性肿瘤之一，近年来确诊人数一直在增加［7］。随着乳腺癌诊断和治疗水平不断提高，患者的生存时间和生活质量得到了初步改善。由于其发病机制目前仍未完全揭示，因此预后改善程度难以满足临床需要［8］。本研究首次发现DHX16基因在乳腺癌组织中高表达，提示该分子参与乳腺癌发生与进展。本研究对其进行初步研究，为临床乳腺癌预后提供新的思路。

DHX16属于DEAD/H盒解旋酶家族［9］。该家族成员与多种恶性肿瘤及自身免疫性疾病相关［10］。DHX16具有ATP结合RNA解旋酶活性，参与细胞周期的进展和人类前体mRNA剪接过程［9］，DHX16的缺失可导致前体mRNA滞留在细胞核内，无法进行蛋白质翻译［11］。另外有文献［12］报道，DHX16通过影响mRNA剪接过程，在肺癌发展中起重要作用。本研究首次发现DHX16高表达不利于乳腺癌预后，其原因可能是DHX16高表达可调节癌基因前体mRNA的剪接、转运出核并表达，促进乳腺癌的发生和进展，不利于乳腺癌预后。

对DHX16表达与临床指标进行相关性分析，发现乳腺癌患者DHX16表达与PAM50不同分子亚型相关，Basal型乳腺癌患者的DHX16表达水平最高，其次是LumB型、Her2型和LumA型乳腺癌患者。乳腺癌患者DHX16表达受种族的影响，表达具有种族特异性。乳腺癌患者DHX16表达与乳腺癌病理分期相关，随着分期增加表达上升，提示DHX16高表达可能促进乳腺癌进展。乳腺癌患者DHX16表达与乳腺癌M分期相关，远处转移M1期高于M0期，提示DHX16高表达可能促进乳腺癌转移。乳腺癌患者DHX16表达与乳腺癌T分期相关，随着肿瘤直径增大表达上升，提示DHX16高表达可能与细胞增殖相关。

基因拷贝数增加通常会引起基因表达上升［13］，本研究发现DHX16表达水平与其基因拷贝变化正相关。异常的启动子DNA过度甲基化通常是导致基因沉默的调节因素之一，有研究［14］报道DNA甲基化影响乳腺癌的基因表达谱，从而影响乳腺癌的分型，同时也被作为某些癌症治疗的靶点。本研究中，DHX16基因甲基化水平与其表达水平呈负相关，说明DNA低甲基化促进了DHX16的表达。

本研究运用多组学高通量数据库分析乳腺癌患者样本，基于数据库数据大、随访时间长、组学数据完备，DHX16高表达不利于乳腺癌患者预后这一结果的可信度高，可作为乳腺癌预后的一个潜在标志物。但研究也存在一些不足，如分析结果受到样本来源的限制。后续研究中，本课题组会在更多临床乳腺癌患者样本中验证DHX16的表达差异，并进一步研究DHX16参与乳腺癌进展的分子机制。