红芪复方对CCl4致小鼠肝损伤防治作用的筛方研究
2019-05-15杨亚飞杨秀艳薛志远方瑶瑶周湘琳赵良功封士兰
杨亚飞,杨秀艳,薛志远,方瑶瑶,周湘琳,赵良功,封士兰*
(1.兰州大学药学院,兰州 730000;2.兰州大学第二医院,兰州 730000)
舒肝消积丸是国医名师周信有的临床经验方,对乙型肝炎具有显著疗效[1],同时能调节机体免疫[2]、抗肝损伤和促进肝损伤的修复[3]。在舒肝消积丸的处方配比基础上,总结了4个红芪复方经验方,红芪为主药,由红芪、丹参、郁金、柴胡、当归、莪术、茵陈、板蓝根、五味子和女贞子等中药组成。红芪(RadixHedysari)也称为独根,为豆科植物多序岩黄芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的干燥根,是甘肃道地药材。本实验选取4个红芪复方经验方,用四氯化碳(CCl4)致小鼠肝损伤,筛选对肝损伤防治效果最佳的红芪复方。
1 仪器与材料
1.1仪器 KQ3200DE 数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Sartorius BP211D电子天平(德国赛多利斯公司);FA2104 电子天平(上海市安亭电子仪器厂);550酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad 公司);UV-1700 紫外分光检测仪(日本岛津公司);DP73显微镜(日本OLYMPUS 公司)
1.2试药 联苯双酯滴丸(万邦德制药集团股份有限公司,批号20151019,规格:1.5 mg·粒-1)。所有药材均购于兰州惠仁堂大药房,经兰州大学生药学研究所马志刚教授鉴定为正品。4个红芪复方的组成分别为:红芪复方一:红芪、丹参、郁金和柴胡;红芪复方二:红芪、丹参、郁金、柴胡和五味子;红芪复方三:红芪、茵陈、丹参、女贞子和莪术;红芪复方四:红芪、丹参、当归、板蓝根和五味子。各复方分别加入药材总量的8倍量水,煎煮3次,每次1.5 h,合并煎煮液,浓缩得浸膏。四氯化碳(CCl4,天津市大茂化学试剂厂);花生油(山东鲁花集团有限公司);考马斯亮蓝试剂盒(批号20170421)、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒(批号20170425)、谷草转氨酶(AST)试剂盒(批号20170425)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号20170424)和丙二醛(MDA)试剂盒(批号20170424),苏木素-伊红(HE)染液(批号20170425),均由南京建成生物工程研究所提供。
1.3实验动物 昆明种小鼠,雄性,体质量为20±2 g,合格证号:SCXK(甘)-20130002,由兰州大学实验动物中心提供。
2 方法
2.1动物分组及给药 取雄性昆明种小鼠84 只,适应性饲养1周后,随机分为空白组、模型组、阳性对照组和4个红芪复方组,每组12 只。模型组按照10 mL·kg-1皮下注射CCl4-花生油溶液(2∶8) 造小鼠肝损伤模型,每周1次,连续7周,形成肝损伤。除空白组外,各组均按照模型组同法造模。造模同时,阳性对照组每天灌胃联苯双酯滴丸(100 mg·kg-1),4个给药组每天给予红芪复方(原药材20 g·kg-1)灌胃,空白组和模型组每天给予生理盐水,剂量为10 mL·kg-1,连续7周。末次给药后禁食24 h,摘眼球,取血,以3 000 r·min-1离心,静置10 min,分离出血清。采血后处死小鼠,取部分肝左叶,置于3.6 mol·L-1甲醛水溶液(体积分数为10%的福尔马林溶液)中固定,剩余肝左叶置于冻存管中,在-80 ℃冰箱中冻存备用。
2.2检测指标和检测方法
2.2.1血清ALT和AST的活性测定 严格按照试剂盒说明书步骤进行测定。
2.2.2肝组织SOD 活力及 MDA 含量的测定 取一部分肝脏组织,用生理盐水制成质量浓度为0.1 g·mL-1的肝组织匀浆,按照试剂盒说明书方法操作,检测肝组织中蛋白质含量、SOD的活力和MDA 的含量。
2.2.3肝组织病理学观察 多聚甲醛固定后的肝组织经常规脱水、石蜡包埋、切片后,用HE染色,观察肝组织病理学变化。
2.3数据处理 实验数据以x±s表示,采用SPSS 19.0 软件统计,组间比较采用单因素方差分析,以P≤0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1对CCl4诱导的肝损伤小鼠体质量的影响 与空白组比较,模型组小鼠的体质量明显降低(P<0.05),说明CCl4造模会降低小鼠体质量。与模型组比较,阳性对照组和各红芪复方组小鼠体质量变化差异均无统计学意义,说明本实验条件下阳性对照组和红芪复方各组对小鼠的体质量无明显影响。见表1。
3.2对CCl4诱导的肝损伤小鼠肝脏指数的影响 与空白组比较,模型组小鼠的肝脏指数明显升高(P<0.05),说明CCl4造模会升高小鼠肝脏指数。与模型组比较,阳性对照组和各红芪复方组小鼠肝脏指数变化差异均无统计学意义,说明本实验条件下阳性对照组和红芪复方各组对小鼠的肝脏指数无明显影响。见表1。
3.3对CCl4诱导的肝损伤小鼠 ALT和AST含量的影响 与空白组比较,模型组小鼠血清 ALT和AST 水平明显升高,差异有显著统计学意义(P<0.05),说明CCl4诱导小鼠肝损伤的模型建立成功;与模型组比较,阳性对照组和红芪复方各组ALT和AST水平明显降低(P<0.05)。与阳性对照组比较,红芪复方三组ALT差异有显著统计学意义(P<0.05),且更能降低ALT水平,AST水平比较差异无统计学意义,表明红芪复方三组效果最佳。见表2。
表1 红芪复方对CCl4诱导的肝损伤小鼠肝脏指数的影响
组别剂量/g·kg-1体质量/g肝质量/g肝脏指数/mg·g-1空白组37.98±3.801.31±0.2234.51±4.07模型组31.89±6.78∗1.87±0.56∗58.12±10.10∗阳性对照组0.133.28±5.142.04±0.4561.01±8.91红芪复方一组2033.31±5.421.97±0.2959.77±7.13红芪复方二组2034.78±4.852.11±0.2861.01±4.34红芪复方三组2033.99±3.962.10±0.3162.11±8.37红芪复方四组2035.80±5.622.12±0.3159.87±7.37
注:与空白组比较*P<0.05。
表2 红芪复方对CCl4诱导的肝损伤小鼠血清ALT和AST含量的影响
组别剂量/g·kg-1ALT水平/U·L-1AST水平/U·L-1空白组37.33±11.06117.34±19.39模型组152.42±16.55∗270.58±21.41∗阳性对照组0.180.05±11.68#158.19±21.64#红芪复方一组2099.28±15.22#△189.10±16.27#△红芪复方二组2067.55±12.48#△204.73±16.67#△红芪复方三组2058.05±10.59#△162.42±18.06#红芪复方四组20125.05±9.30#△220.57±17.90#△
注:与空白组比较*P<0.05;与模型组比较#P<0.05;与阳性对照组比较△P<0.05。
3.4对CCl4诱导的肝损伤小鼠肝组织匀浆SOD和MDA的影响 与空白组比较,模型组肝组织SOD 活性明显降低(P<0.05),小鼠肝组织的 MDA 含量明显升高(P<0.05);与模型组比较,阳性对照组和各红芪复方组均能明显升高SOD活性(P<0.05)以及降低肝组织MDA含量。与阳性对照组比较,红芪复方三组SOD 和MDA差异均无统计学意义,表明红芪复方三组与阳性对照组效果无差异。见表3。
表3 红芪复方对CCl4诱导的肝损伤小鼠肝组织匀浆SOD和MDA的影响
组别剂量/g·kg-1SOD水平/U·mgprot-1MDA水平/nmol·mgprot-1空白组181.91±30.131.48±0.63模型组123.15±31.90∗3.26±1.20∗阳性对照组0.1220.39±41.89#2.43±0.73#红芪复方一组20269.11±43.41#△1.80±0.95#红芪复方二组20242.18±48.11#2.08±1.08#红芪复方三组20203.06±41.15#2.21±0.73#红芪复方四组20206.00±35.30#2.39±0.55#
注:与空白组比较*P<0.05;与模型组比较#P<0.05;与阳性对照组比较△P<0.05。
3.5对CCl4诱导的肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响 肝组织切片经HE 染色后,在光镜下观察,空白组小鼠肝组织清晰,肝小叶结构完整,肝细胞呈放射状排列,汇管区清楚。模型组小鼠肝细胞发生空泡样变,水肿严重,脂肪变性,排列不规整,可见少量灶状坏死,是典型的肝损伤病理特征,说明CCl4造模成功。与模型组比较,阳性对照组和各红芪复方组细胞肿胀范围、变性程度和肝组织坏死区域等病理性损伤均有不同程度的减轻,以红芪复方三组损伤程度最低,与生化指标测定结果一致。见图1。
图1 各组小鼠肝脏HE染色病理切片(10×20)
A.空白组;B.模型组;C.阳性对照组;D.红芪复方一组;E.红芪复方二组;F.红芪复方三组;G.红芪复方四组。
Fig.1 HE staining pathological sections of liver of mice in each group (10×20)
A.normal control group;B.model group;C.positive control group;D.the traditional Chinese medicine prescription 1 ofRadixHedysarigroup;E.the traditional Chinese medicine prescription-2 ofRadixHedysarigroup;F.the traditional Chinese medicine prescription-3 ofRadixHedysarigroup;G.the traditional Chinese medicine prescription-4 ofRadixHedysarigroup.
4 讨论
肝损伤是指在理化因素作用下,肝细胞发生肿胀、变性、坏死和凋亡等不同程度的病变,是多种肝脏疾病共有的病理状态[4-5]。本研究采用的CCl4致化学性肝损伤小鼠模型是目前使用最为广泛的肝损伤动物模型[6-8]。
研究证实,CCl4诱导肝损伤的机制是CCl4被肝微粒体细胞色素P450 代谢活化,产生·CCl3、CCl3OO·等一系列自由基[9],过量的自由基进而引起肝微粒体细胞膜的脂质过氧化,使肝细胞膜结构和功能的完整性遭到破坏,从而导致肝细胞损伤、坏死[10-11]。当肝细胞发生损伤时,细胞膜结构被破坏,膜通透性改变,使可溶性酶ALT和AST由细胞内渗漏进入血循环,引起血清中ALT和AST水平升高[12]。由此可见,ALT和AST的含量变化能在一定程度上反映肝细胞的受损程度[13]。SOD是清除体内自由基、抑制自由基反应的重要物质基础[14],其活性降低会导致体内氧自由基增多,从而使细胞膜结构与功能受到损伤。SOD在体内的氧化与抗氧化平衡中至关重要,可对损伤起到一定的缓解作用。而MDA 是脂质过氧化的产物,可与体内的生物大分子结合,破坏细胞膜的结构和功能,最终导致细胞肿胀、坏死。因此,SOD 活性和MDA 含量可反映体内脂质过氧化程度,间接反映体内组织和细胞损伤程度[15-17]。
研究结果显示,肝损伤小鼠血清ALT和AST含量明显升高,反映CCl4诱导肝损伤小鼠的肝功能受损;而肝组织匀浆SOD 活性降低,MDA含量增高则反映脂质过氧化程度增强;HE染色的肝组织切片可较直观地反映肝组织病理损伤的程度,与模型组比较,阳性对照组和各红芪复方给药组肝组织坏死区域变小,细胞肿胀、变性等病理性损伤均有不同程度的减轻。
红芪性甘,微温,归肺、脾经,具有补气升阳、固表止汗、生津养血和行滞通痹等功效[18]。丹参、郁金、当归和莪术归肝经,具有养血调肝、调达肝气及活血祛瘀的功效。茵陈、板蓝根和柴胡能消热利湿、利胆退黄。五味子和女贞子为扶益补虚之品,能补益肝肾。红芪复方各组均可明显降低CCl4诱导的化学性肝损伤小鼠血清ALT和AST水平,增强肝组织SOD活性,降低MDA含量,同时还可明显减轻肝组织病变损伤程度。红芪复方三(红芪、茵陈、丹参、女贞子和莪术)效果最佳,具有进一步研究价值。