银杏叶多酚物质不同提取方法的比较研究

向静， 刘付明亮， 崔旭兰， 陈锦桃， 何杜朋， 袁劲松

（1.南方医科大学深圳医院，广东深圳 518000；2.北京大学深圳医院，广东深圳 518000）

银杏叶为银杏科植物银杏（Ginkgo biloba L.）的干燥叶，银杏被誉为植物界的“活化石”。据《本草纲目》等古代医书记载，其性平、味甘苦，具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊降脂之功效。

多酚类化合物是指分子结构中有若干个酚性羟基的植物成分的总称，包括黄酮类、单宁类、酚酸类以及花色苷类等种类[1]，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗肿瘤及抗病毒等生物活性[2，3]。现代研究表明，银杏叶中含有黄酮类、银杏酚酸等多酚类化合物，表现出良好的活性作用，具有十分可观的药用价值和潜在的医药开发前景。目前关于银杏叶多酚类化合物单一提取方法的工艺研究时有报道，但不同提取方法间的比较及新技术的联用尚无相关研究阐述。因此，本研究以多酚提取物得率及含量为指标，比较乙醇提取法、酶法—乙醇提取法、超声波—乙醇提取法、微波—乙醇提取法对银杏叶多酚成分的影响，为其进一步开发应用提供借鉴，现将研究结果报道如下。

1 材料

1.1 药物与试剂 银杏叶由江西樟树天齐堂中药饮片有限公司提供（产地：山东；批号：1702001），经北京大学深圳医院主任中药师袁劲松鉴定为银杏科植物银杏（Ginkgo biloba L.）的干燥叶子。没食子酸对照品（由中国食品药品检定研究院提供，批号：110831-201605）；福林—酚（Folin-Ciocalteu）试剂[生工生物工程（上海）股份有限公司]、体积分数95%乙醇、无水碳酸钠、纤维素酶均为分析纯；水为超纯水。

1.2 仪器 UV-1700紫外分光光度计[岛津企业管理（中国）有限公司]；DL-720E超声仪（上海之信仪器有限公司）；WG900CSL23-K6微波炉（佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司）；高速离心机（安徽中佳中科科学仪器有限公司）；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D循环水真空泵（巩义市予华仪器有限公司）；CP-225D十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）；BS-224S万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）。

2 方法与结果

2.1 银杏叶多酚成分的制备 将银杏叶烘干、粉碎、过80目筛，备用。

2.1.1 乙醇提取法[4，5]称取银杏叶粉末50 g，平行3份，加入20倍量体积分数70%乙醇浸泡1 h，90℃加热提取3次，每次2 h；将提取液趁热抽滤，取上清液浓缩至一定程度，65℃真空干燥，即得银杏叶多酚物质。

2.1.2 酶解—乙醇提取法[6，7]称取银杏叶粉末50 g，平行3份，加入20倍量体积分数70%乙醇和0.5%纤维素酶浸泡1 h，90℃加热回流提取3次，每次2 h，余者操作同上。

2.1.3 超声波—乙醇提取法[8，9]称取银杏叶粉末50 g，平行3份，加入20倍量体积分数70%乙醇浸泡1 h，90℃加热超声（功率350 W）提取3次，每次0.5 h，余者操作同上。

2.1.4 微波—乙醇提取法[10，11]称取银杏叶粉末50 g，平行3份，加入20倍量体积分数70%乙醇浸泡1h，微波加热（功率500W）提取3次，每次10min。余者操作同上。

2.2 银杏叶多酚提取物得率计算 按“2.1”项下方法操作，以每种提取方法平行制备6份样品，将所得银杏叶多酚提取物烘干至恒质量，称质量，与原药材质量相比计算得率（p）：p（%）=m1/m2×100%。其中：m1为多酚提取物质量，m2为药材质量。

由不同提取方法所制备的银杏叶多酚提取物得率由高至低依次为：酶解—乙醇提取法＞超声波—乙醇提取法＞乙醇提取法＞微波—乙醇提取法。采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析发现，与乙醇提取法比较，酶解—乙醇提取法、超声波—乙醇提取法得率升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 不同提取方法的银杏叶多酚提取物得率比较Table 1 Comparison of the yields of polyphenols extracted from Folium Ginkgo by different extraction methods （n=6）

2.3 银杏叶多酚含量测定[12，13]

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品10.13 mg，加入超纯水溶解、定容于100 mL容量瓶中，配制成含没食子酸浓度为0.101 3 mg/mL的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取乙醇提取法、酶解—乙醇提取法、超声波—乙醇提取法、微波—乙醇提取法制备的银杏叶多酚提取物20.05、20.12、20.13、20.06 mg，加入超纯水溶解、定容于100 mL容量瓶中，配制成含样品浓度分别为0.200 5、0.201 2、0.201 3、0.200 6 g/L的供试品溶液。

2.3.3 标准曲线绘制 分别精密吸取没食子酸对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于容量瓶中，加入超纯水0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 mL，再加福林—酚试剂、10%碳酸钠溶液各1.0 mL，超纯水定容至刻度，充分摇匀，室温下遮光反应30 min；同时，取超纯水1.0 mL，同法同量加入福林—酚试剂、10%碳酸钠溶液，作为空白对照；于760 nm波长处测定吸光度[D（λ）]值。每个样品平行6份，以吸光度值为纵坐标、没食子酸质量浓度为横坐标，计算得回归方程Y=0.186 5X+0.019 5（R2=0.998 9），表明在10.0～50.0 μg/mL范围内呈现良好的线性关系，结果见图1。

图1 标准曲线Figure 1 Standard curve of gallic acid

2.3.4 精密度试验 精密吸取对照品溶液0.3 mL，按“2.3.3”项下操作进行反应，于760 nm处连续测定6次，计算得平均吸光度值为0.576，相对标准偏差（sR）=0.51%，结果表明该法的精密度良好。

2.3.5 重复性试验 精密称取乙醇提取法制备的银杏叶多酚提取物20 mg，平行6份，按“2.3.2”项下制备成样品溶液；精密吸取0.3 mL样品溶液，按“2.3.3”项下操作进行反应后于760 nm处测定吸光度值，计算得平均吸光度值为0.545，sR=0.53%，结果表明该法的重复性良好。

2.3.6 稳定性试验 精密吸取“2.3.2”项下乙醇提取法的银杏叶多酚供试品溶液0.3 mL，按“2.3.3”项下操作进行反应后每隔1 h于760 nm处测定吸光度值，连续6 h，计算得平均吸光度值为0.544，sR=0.59%，结果表明该法的稳定性良好。

2.3.7 加样回收率试验 精密吸取已知浓度的乙醇提取法制备的银杏叶多酚提取物样品溶液（0.200 5 g/L）0.1 mL，分别加入质量浓度0.101 3 g/L的没食子酸对照品溶液0.07、0.09、0.11 mL和超纯水0.83、0.81、0.79 mL，混匀后加入福林—酚试剂、10%碳酸钠溶液各1.0 mL，超纯水定容至刻度，充分摇匀，室温下遮光反应30 min；于760 nm处测定吸光度值，计算得平均回收率分别为98.99%、98.37%、98.34%，sR为0.87%、0.67%、0.33%，结果表明该法准确性良好。结果见表2。

表2 加样回收率试验结果Table 2 The results for recovery test （n=3）

2.3.8 不同提取方法的银杏叶多酚含量测定 精密吸取“2.3.2”项下不同提取方法的银杏叶多酚溶液0.3 mL，平行6份，按“2.3.3”项下操作进行反应后于760 nm处测定吸光度值，代入标准曲线计算出多酚含量，同时利用SPSS 19.0统计软件对乙醇提取法与其他3种方法进行T检验统计学分析，结果见表3。

由表3可知，4种不同提取方法所制备的银杏叶多酚含量均较高，含量高低依次为：酶解—乙醇提取法（6.89±1.04）%＞超声波—乙醇提取法（6.71±0.06）%＞微波—乙醇提取法（5.97±1.00）%＞乙醇提取法（5.42±0.06）%。与乙醇提取法比较，其他3种方法提取的银杏叶多酚含量均升高（P＜0.05或P＜0.01），尤以酶解—乙醇提取法、超声波—乙醇提取法更为明显。

表3 不同提取方法的银杏叶多酚含量比较Table 3 Comparison of the contents of polyphenols extracted from Ginkgo Folium by different extraction methods （n=6）

3 讨论

本研究采用新技术酶解法、超声波法、微波法辅助乙醇提取法进行银杏叶多酚成分的制备，结果表明，不同提取方法所得银杏叶多酚含量及提取物得率不一，就提取物得率而言，以酶解—乙醇提取法最高（12.71±0.09）%，其次为超声波—乙醇提取法（12.45±0.11）%、乙醇提取法（11.78±0.13）%、微波—乙醇提取法最低（11.39±0.10）%。就含量而言，则以酶解—乙醇提取法最高（6.89±1.04）%，其次为超声波—乙醇提取法（6.71±0.06）%、微波—乙醇提取法（5.97±1.00）%、乙醇提取法最低（5.42±0.06）%。提示新技术、新方法的创新集成应用，对制备银杏叶多酚成分可以起到显著的协同增强效果。

与传统提取方法相比，新技术新方法具有耗能少、时间短、效率高等特点[14]。本研究结果表明，在提取时间方面，乙醇提取法=酶解—乙醇提取法＞超声波—乙醇提取法＞微波—乙醇提取法；而在指标成分提取率方面，酶解—乙醇提取法＞超声波—乙醇提取法＞微波—乙醇提取法＞乙醇提取法。其中：超声提取法主要利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速胞内有效物质的释放、扩散和溶解；微波提取法以高频电磁波穿透至介质内部，通过热能转化提高细胞内部压力，促使细胞破裂而释放有效物质；酶法则通过专一高效的活性酶来水解特定的某种物质结构，使其目标成分有效释放。由此可见，改变传统单一方法制备模式，创新应用现代化技术方法进行有机集成，将是未来中药有效成分制备的发展趋势。