莞香灵芝与市售灵芝中总三萜含量的对比分析

戚怡， 吕思敏， 丁鸿燕， 李林科， 吴铁，， 于丰彦

（1.广东医科大学，广东东莞 523808；2.广东医科大学﹠广东润和生物科技有限公司辅酶Q10联合研究中心，广东东莞 523808）

灵芝药用在我国已有2 000多年的历史，其药用及保健价值一直备受青睐，销量快速增长，但由于野生灵芝资源稀缺，所以对人工栽培灵芝的需求越来越大。“莞香灵芝”是以瑞香科沉香属植物沉香的木屑为栽培原料培养出的一种以灵芝总三萜含量较高为特色的灵芝新品种（专利申请号：201610320833.5）。灵芝总三萜是在灵芝中发现的一类三萜类化合物，是灵芝的主要化学和药效成分，具有抗肿瘤、保肝护肝、降低胆固醇、降血脂、降血糖、抗氧化延缓衰老、抗HIV等功效[1-3]。

为更好地开发和推广莞香灵芝，本研究分别采用2015版《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）及《安徽省地方标准》中的方法检测灵芝总三萜的含量，对7种随机市售的灵芝及人工栽培的莞香灵芝进行对照检测与评价。《中国药典》、《安徽省地方标准》均以紫外分光光度法测定总三萜，以香草醛—冰乙酸显色，区别在于二者提取方法不同，但均有对应的质量评估标准，现将研究结果报道如下。

1 材料

1.1 仪器 FR223CN电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；紫外—可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；水浴锅（上海爱明仪器有限公司）；超声波清理器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 试药与试剂 样品G1～G7（见表1）为随机市售不同来源地的灵芝子实体，均购自广东化州市不同药材批发部；样品G8为实验室用莞香木栽培的灵芝子实体（莞香灵芝，专利申请号：201610320833.5）。齐墩果酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：821882）；无水乙醇、氯仿、高氯酸均为分析纯；5%香草醛—冰乙酸（现配现用）。

1.3 统计方法 采用SPSS 23.0软件进行数据分析，计量资料以均值±标准差(±s)表示，样品含量比较采用方差分析，莞香灵芝（G8）与市售灵芝（G1～G7）总三萜含量比较采用LSD法。

表1 市售灵芝来源信息Table 1 The information of commercial Ganoderma scorces

2 方法与结果

2.1 按《中国药典》标准检测灵芝总三萜含量

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸5mg，用甲醇溶解，超声1 min促溶，用甲醇定容至25 mL量瓶中，4℃冰箱保存，作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 每种试药分别取粉碎的灵芝子实体试样平行2份，精密称取样品各2 g，置于100 mL锥形瓶中，加入50 mL的无水乙醇溶液，超声处理（功率40%、频率53 kHz）45 min；抽滤，滤液置于100 mL容量瓶中，用适量的无水乙醇溶液洗涤容量瓶和滤渣，洗液并入同一容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 标准曲线的绘制 精密量取上述对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分别置于10 mL的EP管中，80～90℃水浴挥干，放冷；加入新配制的香草醛—冰醋酸溶液（精密称取香草醛5 g加入10 mL的冰醋酸，并使它溶解）0.2 mL，高氯酸0.8 mL，摇匀。在70℃水浴中加热15 min；立即水浴中冷却5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，摇匀，以相应试剂为空白，在546 nm处测定吸光度[D（λ）]，以齐墩果酸含量（m/mg）为横坐标X，吸光度D（546 nm）为纵坐标Y，绘制标准曲线。求得回归方程为Y=8.530X-0.038，R2=0.997。灵芝总三萜线性范围为0.02～0.10 mg。标准曲线见图1。

图1 按《中国药典》标准绘制的齐墩果酸标准曲线Figure 1 Standard curve of oleanolic acid drawn following Chinese Pharmacopoeia standard

2.1.4 样品的含量测定 取供试品适量，置于10mL的EP管中80～90℃水浴挥干，放冷；加入新配制的香草—醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，摇匀，在70℃水浴中加热15 min，立即水浴中冷却5 min；取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，摇匀。以相应试剂为空白，在546 nm处测定吸光度[D（λ）]，平行2份，取平均吸光度D（546 nm）。通过线性回归方程算得测定用的样液中三萜类物质的质量。按公式计算各样品总三萜含量（w）：w（g/100 g）=（m2×V1）/（m1×V2×1 000）×100。其中：m2为回归方程计算出的含量；m1为试样的质量；V1定容体积；V2使用样液的体积。结果见表2。

表2 莞香灵芝与市售灵芝总三萜含量测定结果（按《中国药典》标准测定）Table 2 The determination results for the contents of total triterpenoids in Guanxiang Ganoderma and commercial Ganoderma according to Chinese Pharmacopoeia standard

2.2 按安徽省地方标准检测灵芝总三萜含量

2.2.1 对照品溶液的制备 齐墩果酸储备液（0.1 mg/mL）：精密称取95℃干燥2 h的对照品10.0 mg用无水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶，作为标准品储备液（4℃保存）。

2.2.2 供试品溶液的制备 每种试药分别取粉碎的灵芝子实体试样1份，精密称取样品各1 g，准确至0.1 mg。置于100 mL圆底烧瓶中，加入30 mL氯仿。（60±1）℃水浴回流2 h，减压过滤，滤渣加入30 mL氯仿，再回流1 h，常压过滤。合并滤液，40℃旋蒸至干。加入无水乙醇约40 mL，70℃水浴加热，并摇动至其完全溶解。冷却至室温后用无水乙醇定容至50 mL，等待测液。

2.2.3 标准曲线的绘制 取标准品储备液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL置于10 mL EP管中，常压水浴蒸干溶剂（98～100℃）。加入新配制的5%香草醛—冰乙酸溶液0.20 mL和高氯酸0.80 mL，摇匀。70℃水浴加热15 min，取出，冰水冷却5 min，用自来水浴调至室温。用移液管准确移取冰乙酸5.00 mL稀释，摇匀。以试剂空白做参照，在30 min内用紫外可见分光光度计在545 nm处测吸光度[D（λ）]值。以吸光度D（545 nm）为纵坐标Y，以三萜含量（m/mg）为横坐标X，绘制标准曲线，求出直线回归方程并计算相关系数。求得回归方程为Y=8.288X-0.040，R2=0.996。灵芝总三萜线性范围为0.01～0.12 mg。标准曲线见图2。

图2 按安徽省地方标准绘制的齐墩果酸标准曲线Figure 2 Standard curve of oleanolic acid drawn following Anhui local standard

2.2.4 样品的含量测定 吸取待测液适量于25 mL具塞比色管中，常压水浴蒸干溶剂（98～100℃）。加入新配制的5%香草醛—冰乙酸溶液0.20 mL和高氯酸0.80 mL，摇匀。70℃水浴加热15 min，取出，冰水冷却5 min，用自来水浴调至室温。加冰乙酸5.00 mL稀释，摇匀。以试剂空白做参照，在30 min内用紫外可见分光光度计在545 nm处测吸光度[D（λ）]值。通过线性回归方程算得测定用的样液中三萜类物质的质量。按下面公式计算各样品灵芝总三萜含量（w）：w（g/100 g）=[m2/m1（1-w′）×（V2/V1）×1 000]×100。其中：m1为试样的质量，单位为g；m2为通过线性回归方程算得的测定用样液中三萜类物质的质量，单位为mg；V1为待测液定容的体积，单位为mL；V2为测定用的样液体积，单位为mL；w′为试样的含水量，单位为克每百克（g/100 g）。结果见表3。

表3 莞香灵芝与市售灵芝总三萜含量测定结果（按安徽地方标准测定）Table 3 The determination results for the contents of total triterpenoids in Guanxiang Ganoderma and commercial Ganoderma according to Anhui local standard

2.3 《中国药典》方法检测莞香灵芝与市售灵芝总三萜含量的差异性对比 由表4～6可看出，8种灵芝含量之间存在显著性差异（P＜0.05），莞香灵芝平均含量显著高于其他7种市售灵芝平均含量（P＜0.05），G1的平均含量显著低于其他种灵芝的平均含量（P＜0.05）。

3 讨论

灵芝为食药两用真菌，我国已将灵芝列入《中国药典》范围之内，并可根据灵芝的实体中的主要活性成分和营养成分高低对其进行全面的功能评价[4]。灵芝中所含灵芝三萜具有显著的药理活性，《中国药典》及地方标准中均以检测总三萜成分作为评价灵芝质量中必不可少的重要指标之一。安徽省是我国最重要的灵芝产区，其中宣城旌德县及大别山是有名的灵芝培植基地，安徽省地方标准（DB34/T 485—2004）中建立的大别山灵芝的标准是国内较早制定的地方标准，有重要行业代表的参考意义，其有机溶剂回流提取主要是运用总三萜溶于一些有机溶剂，使得总三萜装入到溶剂中而除去不溶性的杂质。而《中国药典》要求试品经过超声波提取，利用超声波产生强烈震荡、高速和在溶剂和样品之间产生声波空化作用，导致溶液内气泡的形成、增长和爆破压缩，破坏植物药材的细胞，使溶剂能够渗透到药材细胞中，提高目标物从固相转移到液相的传质速率。本研究采用上述2种方法，以齐墩果酸为对照品，用紫外—可见分光光度法，对灵芝总三萜含量进行测定，测得莞香灵芝及市售灵芝中灵芝总三萜含量。按照《中国药典》方法检测，灵芝总三萜不得少于0.50%，本研究测得长白山、广西、江西产灵芝，莞香灵芝均符合要求，莞香灵芝和市售灵芝（分别产自安徽、山东、河南、长白山、广西、广东、江西等地）等8种灵芝含量之间存在显著性差异（P＜0.05），莞香灵芝平均含量显著高于其他7种市售灵芝平均含量（P＜0.05），安徽产灵芝子实体的平均含量显著低于其他种灵芝的平均含量（P＜0.05）。按照安徽省地方标准方法检测：灵芝总三萜含量（w/%）≥1.2，本研究测得仅有莞香灵芝符合要求。本研究结果表明，莞香灵芝的灵芝总三萜含量明显高于市售其他品种的灵芝，并符合中国药典及地方标准的要求。提示以莞香木为原料栽培的灵芝可能具有更好的药理功效，在食用、保健及药用研发时可以优先选择总三萜含量更高的莞香灵芝。

表4 莞香灵芝与市售灵芝总三萜的含量Table 4 Comparison of Guanxiang Ganoderma and commercial Ganoderma (±s)

表4 莞香灵芝与市售灵芝总三萜的含量Table 4 Comparison of Guanxiang Ganoderma and commercial Ganoderma (±s)

编号G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8份2 2 2 2 2 2 2 2灵芝总三萜含量（w/%）0.354±0.049 0.455±0.031 0.370±0.030 0.600±0.008 0.727±0.006 0.370±0.022 0.523±0.070 0.937±0.091

表5 8种灵芝平均含量的差异性分析Table 5 Differentiation among average contents in 8 kinds of Ganoderma

表6 莞香灵芝与市售灵芝总三萜含量对比Table 6 Comparison of contents of total triterpenoids in Guanxiang Ganoderma and commercial Ganoderma

很多研究[5-7]表明，不同栽培条件、不同栽培方式、不同处理下培养的灵芝在重要成分的含量方面存在显著差异。莞香，为瑞香科沉香属木，是在我国树木中唯一以“东莞”命名的树木，历来是东莞的特产，其老茎受伤后所积得的树脂，俗称沉香，可作香料原料，亦为治胃癌特效药。为了得到更多的沉香，每年莞香农都要对莞香木进行凿采，剔除下来的白木香下脚料可充分利用为莞香灵芝栽培原料。利用莞香木屑为原料培植出的灵芝中总三萜含量较高，这可能与培养基质中的莞香木的养分及活性成分迁移有关。

本研究测得莞香灵芝中总三萜含量明显高于市售的不同品种灵芝，符合《中国药典》及地方标准的要求，为莞香灵芝的开发与利用提供了有意义的科学依据。