迷迭香叶中鼠尾草酸的超声破碎提取工艺 及其抗油脂氧化研究

罗小芳， 陈启燕， 王 钗， 姜红宇， 王宗成

(1.湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南 永州 425199； 2.湖南省湘南优势植物资源综合利用重点实验室，湖南 永州 425199)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)，属唇形科迷迭香属植物，原产于欧洲、北非以及地中海沿岸[1]，1981年中国科学院植物所在我国贵州等地成功进行了引种[2]，目前在广西、贵州、云南、浙江等地广泛种植[1]。迷迭香含有丰富的抗氧化成分，主要有二萜类、黄酮类、三萜类等化合物[3]，其中二萜类的鼠尾草酸是含量最高、活性最强的脂溶性抗氧化成分[4]，对油脂具有较好的抗氧化活性[5-7]。此外，鼠尾草酸还具有抗癌、抗炎、抑菌、神经保护等药理活性[8-10]，已被广泛用于药品、食品、化妆品等领域。目前，鼠尾草酸的提取主要以热回流法[11]为主，耗时长，得率较低，且鼠尾草酸在较高温度的溶剂中存在时间较长容易转化为鼠尾草酚[12]，增加后续纯化难度，虽然有在较低温度下的超声辅助提取鼠尾草酸的报道[12-13]，但是提取时间仍较长。因此，寻求一种高效、快速的鼠尾草酸提取方法具有重要意义。超声破碎提取法通过将发射超声波的探头直接插到混有原料的溶剂中，使原料直接受超声波的作用，促使原料中的有效成分快速溶于溶剂中，具有操作简便、工艺周期短、有效成分不被破坏等优点[14]。本文以迷迭香叶为原料，研究了鼠尾草酸的超声破碎提取工艺，并采用Schaal烘箱法研究迷迭香叶中鼠尾草酸对油脂的抗氧化作用，为迷迭香叶的开发与利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

迷迭香叶(市售)。无水乙醇、磷酸、BHT、BHA、抗坏血酸(VC)、一水柠檬酸，分析纯；甲醇，色谱纯。

1.1.2 仪器与设备

JYD-1200L超声波细胞粉碎机，上海之信仪器有限公司；TE124S型电子天平，德国赛多利斯；AHS-370型恒温烘箱，吴江华东标准烘箱有限公司；RE-201D型旋转蒸发仪，长沙泰康仪器有限公司；LC-20AT型高效液相色谱仪，日本岛津有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 鼠尾草酸的提取

将迷迭香叶放至60℃烘箱干燥2 h，粉碎，过60目筛。精确称取10.0 g迷迭香叶粉置于250 mL烧杯中，加入一定量的提取溶剂，在一定功率下超声破碎提取一定时间，提取液抽滤后，准确测量体积，取约10 mL滤液用0.45 μm的聚偏氟乙烯有机微孔滤膜过滤后作为高效液相色谱待测样品溶液。

1.2.2 高效液相色谱分析条件

月旭C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测波长210 nm；流动相A为0.05%的磷酸水溶液，B为甲醇；流速1.0 mL/min；洗脱梯度见表1。

表1 梯度洗脱

1.2.3 标准曲线的绘制

准确称取鼠尾草酸标准品11.5 mg，用无水乙醇溶解，并定容至10 mL。分别精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL至10 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，取20 μL标准溶液注入液相色谱仪，采用1.2.2色谱分析条件进行测定。以质量(x)为横坐标，峰面积积分值(y)为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归，得到线性回归方程y=303 202x+3 423.6(R2=0.999 9)。

1.2.4 样品溶液的测定

采用1.2.2色谱分析条件，取20 μL待测样品溶液注入液相色谱仪进行测定，根据线性回归方程计算样品溶液中鼠尾草酸的质量浓度，再根据提取液的体积，计算出提取到的鼠尾草酸的质量。参照文献[11]，采用超声辅助浸提法反复提取3次迷迭香叶中的鼠尾草酸，测得10 g迷迭香叶中鼠尾草酸的质量为0.308 g。

1.2.5 鼠尾草酸提取率的计算

1.2.6 鼠尾草酸的纯化

参考文献[15]，将迷迭香叶中鼠尾草酸提取后，采取硅胶层析法进行纯化。

1.2.7 迷迭香叶中鼠尾草酸抗油脂氧化活性的分析

采用Schaal烘箱法，取50 g食用油置于广口瓶中，分别加入一定量纯化的鼠尾草酸和/或其他抗氧剂，使充分混匀，以无添加的油脂为空白对照，放入(65±1)℃的恒温烘箱中进行诱导强制氧化，每隔3 d检测样品的过氧化值。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对鼠尾草酸提取效果的影响

固定乙醇体积分数80%、超声时间3 min与超声功率360 W，考察不同料液比对鼠尾草酸提取率的影响，结果见图1。

图1 料液比对迷迭香叶中鼠尾草酸提取率的影响

由图1可知，当料液比从1∶5增加至1∶15时，鼠尾草酸提取率逐渐提高，继续增加料液比，鼠尾草酸提取率略有降低。增加料液比可以提高有效成分的扩散速度，有助于鼠尾草酸溶出，但当扩散达到平衡时，增加提取剂不会促进鼠尾草酸的提取，反而使之后的浓缩更为困难。因此，综合考虑提取所需的能耗，正交试验选择料液比为1∶10～1∶20。

2.1.2 乙醇体积分数对鼠尾草酸提取效果的影响

固定超声时间3 min、料液比1∶10与超声功率360 W，考察不同乙醇体积分数对鼠尾草酸提取率的影响，结果见图2。

图2 乙醇体积分数对迷迭香叶中鼠尾草酸提取率的影响

由图2可知，乙醇体积分数从60%增加100%时，鼠尾草酸的提取率逐渐升高，当以无水乙醇为溶剂时，鼠尾草酸的提取效果最好。因为鼠尾草酸溶于乙醇，随着乙醇体积分数的提高，溶解度增大，提取率也随之提高。因此，正交试验选取无水乙醇。

2.1.3 超声功率对鼠尾草酸提取效果的影响

以无水乙醇为溶剂，固定料液比1∶10与超声时间3 min，考察不同超声功率对鼠尾草酸提取率的影响，结果见图3。

由图3可知，当超声功率从120 W增加至480 W时，鼠尾草酸提取率提高，继续增加超声功率，鼠尾草酸的提取率反而下降。增大超声功率可以提高植物细胞的破碎度，有助于鼠尾草酸从基质中溶出，但超声功率过高会破坏鼠尾草酸的结构，降低提取率。因此，正交试验选择超声功率为360～600 W。

图3 超声功率对迷迭香叶中鼠尾草酸提取率的影响

2.1.4 超声时间对鼠尾草酸提取效果的影响

以无水乙醇为溶剂，固定料液比1∶10与超声功率360 W，考察不同超声时间对鼠尾草酸提取率的影响，结果见图4。

图4 超声时间对迷迭香叶中鼠尾草酸提取率的影响

由图4可知，当超声时间达到2 min时，鼠尾草酸提取率最高，继续延长超声时间，鼠尾草酸提取率逐渐下降。因此，正交试验的超声时间为1～3 min。

2.2 正交试验优化

在单因素试验的基础上，以鼠尾草酸提取率为指标，选取料液比(A)、超声功率(B)和超声时间(C)作为考察因素，采用正交试验优化迷迭香叶中鼠尾草酸的提取工艺条件，正交试验因素水平见表2，正交试验设计与结果见表3，方差分析见表4。

由表3可知，各因素对鼠尾草酸提取率影响大小依次为C>B>A，即超声时间>超声功率>料液比，优化工艺组合为A1B3C2。由表4可知，超声时间对鼠尾草酸提取率的影响显著，超声功率和料液比对鼠尾草酸提取率的影响不显著。最佳工艺条件为料液比1∶10、超声功率600 W、超声时间2 min，在此条件下进行6次平行试验，得到鼠尾草酸的平均提取率为93.6%。与文献[12-13]相比，提取时间大幅缩短。

表2 正交实验的因素与水平

表3 正交试验设计与结果

表4 方差分析

注：F0.05=19.000。

2.3 迷迭香叶中鼠尾草酸对油脂的抗氧化作用

2.3.1 迷迭香叶中鼠尾草酸对不同油脂的抗氧化作用

将0.02%的鼠尾草酸分别添加到猪油、菜籽油和花生油中，同时分别以猪油、菜籽油、花生油作空白对照，按Schaal烘箱法测定3～15 d时油脂的过氧化值，研究鼠尾草酸对不同油脂的抗氧化作用。结果见图5。

图5 鼠尾草酸对不同油脂的抗氧化作用

由图5可知，随着时间的延长，油样的过氧化值均有不同程度的上升，但是添加鼠尾草酸的油样较相应的空白油样过氧化值增长缓慢，而空白油样过氧化值急剧上升，表明鼠尾草酸对3种油脂的氧化酸败都有不同程度的抑制作用。

2.3.2 不同添加量的鼠尾草酸对猪油的抗氧化作用

分别在猪油中添加0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%的鼠尾草酸，同时以猪油作空白对照，测定3～15 d时油脂的过氧化值，研究不同添加量鼠尾草酸对油脂的抗氧化作用。结果见图6。

图6 不同添加量的鼠尾草酸对猪油的抗氧化作用

由图6可知，随着鼠尾草酸添加量的增大，猪油的过氧化值呈下降趋势，即其抗氧化效率增强。因此，鼠尾草酸对猪油的抗氧化能力有剂量效应的关系，可以根据实际需要控制鼠尾草酸的添加量达到所需的抗氧化效果。

2.3.3 迷迭香叶中鼠尾草酸与其他抗氧剂对猪油的抗氧化作用

将0.02%鼠尾草酸、0.02%BHT、0.02%BHA、0.02%抗坏血酸、0.02%柠檬酸分别添加至50 g猪油中，同时以猪油作空白对照，测定3～15 d时油脂的过氧化值。结果见图7。

图7 鼠尾草酸与其他抗氧剂对猪油的抗氧化作用

由图7可知，随着时间的延长，油样的过氧化值均有不同程度的上升，但加入抗氧剂后的油样过氧化值都明显低于空白对照，且鼠尾草酸样品试验组总体过氧化值较低，抗氧化效果接近BHT试验组，鼠尾草酸具有比BHA以及柠檬酸更强的抗氧化性。由此看出，鼠尾草酸有较大的开发潜力。

2.3.4 鼠尾草酸与其他抗氧剂的协同增效作用

分别取0.02%鼠尾草酸与0.02%BHA、0.02%BHT、0.02%抗坏血酸、0.02%柠檬酸4种复配物及0.04%鼠尾草酸分别加入到50 g猪油中，并以猪油作空白对照，测定3～15 d时油脂的过氧化值，研究鼠尾草酸与其他抗氧剂的协同增效作用。结果见图8。

图8 鼠尾草酸与其他抗氧剂的协同增效作用

由图8可知，随着时间的延长，空白油样过氧化值急剧上升，而添加鼠尾草酸复配物的油样明显低于空白，鼠尾草酸与柠檬酸复配试验组、鼠尾草酸与抗坏血酸复配试验组抗氧化效果强于单一鼠尾草酸试验组，对猪油的抗氧化效果由强到弱依次为抗坏血酸+鼠尾草酸>柠檬酸+鼠尾草酸>鼠尾草酸>BHA+鼠尾草酸>BHT+鼠尾草酸。由此可知，有机酸与抗氧化剂协同使用可增强其抗氧化功能。可能由于有机酸与油中某些金属离子螯合形成金属盐，降低了微量金属离子对油脂氧化的催化能力，从而增加了鼠尾草酸的抗氧化效果[16-17]。

3 结 论

采用单因素试验和正交试验优化了超声破碎提取迷迭香叶中鼠尾草酸的提取工艺，得到最佳工艺条件为：以无水乙醇为溶剂，料液比1∶10，超声功率600 W，超声时间2 min。在最佳工艺条件下，迷迭香叶中鼠尾草酸的提取率可达到93.6%。抗氧化活性分析表明，迷迭香叶中鼠尾草酸对花生油、菜籽油和猪油都具有较强的抗氧化活性，且对油脂的抗氧化能力与鼠尾草酸添加量呈正相关，鼠尾草酸比BHA以及柠檬酸具有更强的抗油脂氧化活性，且与抗坏血酸和柠檬酸有一定的协同增效作用。