鱼油中EPA和DHA的酶法富集工艺研究

王国财，刘菊妍，苏薇薇，黄建军，许文东，唐顺之，关伟键，熊淑娴

(1.中山大学 生命科学学院，广州 510006； 2.广州白云山汉方现代药业有限公司 中药提取分离过程现代化国家工程研究中心，广州 510006； 3.广州医药集团有限公司，广州 510006)

鱼油是一种从鱼类中提取精炼而成的油脂，富含ω-3脂肪酸[1]。ω-3脂肪酸中的二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)是鱼油的主要功效成分，不仅是构成脑膜脂质的主要成分，而且还具有调节血脂、降低血液黏稠度、健脑益智、改善和增加记忆、增强人体免疫功能、抑制炎症及改善视力等功效[1-5]。由注射用精制鱼油为原料制备的ω-3鱼油脂肪乳注射液可以快速增加细胞膜ω-3脂肪酸含量，临床上发挥抗炎和免疫调节作用，降低并发症，并且对于危重症病人，能显著降低病死率，减少抗生素用量，缩短住院时间[6-7]。

天然来源的鱼油主要成分为甘油三酯，几乎不含甘油二酯、甘油一酯，不存在脂肪酸乙酯等人工合成的成分。据报道，鱼油甘油三酯中Sn-1位主要为饱和脂肪酸[8]，而Sn-1,3特异性脂肪酶水解短链脂肪酸酯键的速率比水解长链脂肪酸酯键要快，因此可以利用该酶水解速率的差异，将1,3位含饱和脂肪酸的甘油三酯水解成甘油二酯、甘油一酯等[9-10]。而且偏甘油酯脂肪酶能够将甘油二酯、甘油一酯转化为脂肪酸[10-11]，并参照经典方法进行碱炼脱酸[8]，从而提高鱼油中EPA和DHA的含量，同时保持精制鱼油的天然属性。

目前国内外关于精制鱼油制备工艺更多的是关于食品级精制鱼油的工艺报道[11-14]。目前为了提高EPA和DHA含量，制备食品级精制鱼油的方法主要包括酶法和化学法，精制得到的鱼油均为合成的鱼油，没有很好地控制脂肪酸乙酯、甘油二酯、甘油一酯等杂质。本文先利用固定化Sn-1,3特异性脂肪酶水解鱼油中1,3位含饱和脂肪酸的甘油三酯，再利用偏甘油酯脂肪酶将水解产生的甘油二酯、甘油一酯转化为脂肪酸[10]，最后参照经典方法进行碱炼脱酸[8]，从而精炼得到高含量EPA和DHA的保持天然属性的精制鱼油。

1 材料与方法

1.1 实验材料

食品级鱼油(舟山新诺佳生物工程有限责任公司)；EPA甲酯(标准品，批号62390099，上海安谱实验科技股份有限公司)；DHA甲酯(标准品，批号62380079，上海安谱实验科技股份有限公司)；固定化Sn-1,3特异性脂肪酶(TLIM，日本天野酶制品株式会社)；偏甘油酯脂肪酶(Lipase G50，日本天野酶制品株式会社)；纯化水(自制)；三氯甲烷、甲醇、三氟化硼、氢氧化钠、氯化钠、无水硫酸钠等，均为分析纯。

DF-101s集热式恒温加热磁力搅拌器；GC-7890N气相色谱仪(美国安捷伦公司)；LXJ-IIB离心机。

1.2 实验方法

1.2.1 EPA和DHA富集工艺

取100.0 g食品级鱼油，加入一定量的固定化Sn-1,3特异性脂肪酶(以下简称脂肪酶)，加入一定量的纯化水，在一定温度、时间、pH 6条件下搅拌水解，离心去除固定化Sn-1,3特异性脂肪酶与水，得到部分水解的甘油酯混合物。向甘油酯混合物加入5.0 g偏甘油酯脂肪酶、2.0 g纯化水，30℃、pH 6条件下搅拌水解3 h，离心去除偏甘油酯脂肪酶与水，碱炼脱酸[8]，得到富含EPA、DHA的产品。按下式计算产品收率。

收率=A/100×100%

式中：A为富含EPA和DHA的产品质量，g。

1.2.2 鱼油脂肪酸组成分析

取约0.1 g的鱼油样品置于10 mL容量瓶中，加含50 mg/L BHT的异辛烷溶液溶解并定容，得到样品储备液。取该储备液2 mL，置于20 mL具塞石英玻璃管中，加入1.5 mL 20 mg/mL的氢氧化钠甲醇溶液，充满氮气后盖紧塞子，于65℃水浴加热7 min，待冷却后，加入2 mL三氟化硼甲醇溶液，充满氮气后盖紧塞子，并置于65℃水浴30 min。取出，冷却至40～50℃，加入1 mL异辛烷并充分摇晃30 s，并立即加入5 mL饱和氯化钠溶液，充满氮气后摇晃至少15 s，静置分层。取上层溶液，下层溶液再用1 mL异辛烷洗涤并收集合并上层液。用纯化水洗涤上层液2次，每次1 mL，异辛烷层用无水硫酸钠干燥后，取上清液，用微孔滤膜过滤，进GC分析。

气相色谱条件：J & W122-7032毛细管脂肪酸分析柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；初始柱温170℃，保持2 min，以3℃/min的速度升温至240℃，保持15 min；进样口温度250℃；检测器温度270℃；氮气流速1.2 mL/min；氢气流速30 mL/min；空气流速300 mL/min；进样量2 μL。

2 结果与分析

2.1 EPA和DHA富集单因素实验

2.1.1 脂肪酶用量对EPA和DHA总量及产品收率的影响

在纯化水加入量4%、水解时间3 h、水解温度40℃的条件下，考察脂肪酶用量对EPA和DHA总量及产品收率的影响，结果见图1。

图1 脂肪酶用量对EPA和DHA总量和产品收率的影响

由图1可看出，随着脂肪酶用量的增加，EPA和DHA总量呈现逐渐增加的趋势，但产品收率逐渐减少。综合考虑，脂肪酶用量选择1%～15%的使用范围。

2.1.2 纯化水加入量对EPA和DHA总量及产品收率的影响

在脂肪酶用量10%、水解时间3 h、水解温度40℃的条件下，考察纯化水加入量对EPA和DHA总量及产品收率的影响，结果见图2。

图2 纯化水加入量对EPA和DHA总量和产品收率的影响

由图2可看出，随着纯化水加入量的增加，EPA和DHA总量呈现增加趋势，到了8%后趋于平缓，产品收率则呈现减少的趋势。从效益及环保考虑，选择纯化水加入量1%～10%的使用范围。

2.1.3 水解时间对EPA和DHA总量及产品收率的影响

在脂肪酶用量10%、纯化水加入量4%、水解温度40℃的条件下，考察水解时间对EPA和DHA总量及产品收率的影响，结果见图3。

图3 水解时间对EPA和DHA总量和产品收率的影响

由图3可看出，随水解时间的延长，EPA和DHA总量呈现增加的趋势，到了6 h后趋于平缓；产品收率呈现下降的趋势，到了6 h后趋于平缓。从效益考虑，水解时间选择范围为2～6 h。

2.1.4 水解温度对EPA和DHA总量及产品收率的影响

在脂肪酶用量10%、纯化水加入量4%、水解时间3 h的条件下，考察水解温度对EPA和DHA总量及产品收率的影响，结果见图4。

图4 水解温度对EPA和DHA总量和产品收率的影响

由图4可看出，随着水解温度的升高，EPA和DHA总量呈现增加的趋势，在60℃后趋于稳定，产品收率呈现下降的趋势，在60℃后趋于稳定。从效益考虑，水解温度范围为30～70℃。

由上述实验结果可以看到，影响EPA和DHA富集的主要因素是脂肪酶用量和纯化水加入量。从效率与经济效益出发，富集EPA和DHA优化工艺条件为脂肪酶用量1%～15%、纯化水加入量1%～10%、水解时间2～6 h、水解温度30～70℃，在此条件下EPA和DHA总量为40%～60%，产品收率为48%～75%。

2.2 鱼油脂肪酸组成

食品级鱼油在脂肪酶用量10%、纯化水加入量4%、水解温度40℃、pH 6条件下搅拌水解3 h，采用偏甘油酯脂肪酶除去甘油二酯、甘油一酯，再经碱炼脱酸得到精制鱼油，经甲酯化处理，采用GC对其脂肪酸组成进行分析，通过标准品对照和数据库检索，并按照面积归一化法进行定量分析，结果见表1。

表1 食品级鱼油与精制鱼油脂肪酸组成%

脂肪酸食品级鱼油精制鱼油脂肪酸食品级鱼油精制鱼油豆蔻酸6.65.0C20∶1n-91.40.9棕榈酸15.98.1C20∶1n-70.20.1棕榈烯酸8.76.2花生四烯酸1.31.3C16∶4n-12.22.1C20∶4n-30.81.0硬脂酸3.71.0二十碳五烯酸(EPA)18.029.3油酸9.35.4C22∶1n-111.90.6C18∶1n-73.22.4C21∶5n-30.80.8亚油酸1.51.3C22∶5n-60.60.4亚麻酸1.21.3二十二碳五烯酸(DPA)1.82.2十八碳四烯酸2.44.5二十二碳六烯酸(DHA)13.526.3花生酸0.40.3

由表1可知，精制鱼油中存在21种主要脂肪酸，食品级鱼油经过富集之后，其饱和程度较高的脂肪酸含量降低，豆蔻酸、棕榈酸、棕榈烯酸、硬脂酸、油酸含量分别从6.6%、15.9%、8.7%、3.7%、9.3%降至5.0%、8.1%、6.2%、1.0%、5.4%，而多不饱和脂肪酸含量得到富集，EPA含量从18.0%富集至29.3%，DHA含量从13.5%升高至26.3%。因此，该方法可以有效地富集鱼油中的EPA和DHA。

3 结 论

本研究通过固定化Sn-1,3特异性脂肪酶对食品级鱼油中的EPA和DHA进行富集，并通过单因素实验得出最优富集工艺条件为pH 6、固定化Sn-1,3特异性脂肪酶用量1%～15%、纯化水加入量1%～10%、水解时间2～6 h、水解温度30～70℃，在此条件下EPA和DHA总量达到40%～60%，产品收率为48%～75%。该工艺实现了EPA和DHA的有效富集，同时经过除去甘油二酯、甘油一酯、游离脂肪酸等后处理得到了保持天然属性的精制鱼油。该工艺能够大大提高鱼油中EPA和DHA总量，对于后续天然鱼油药品及保健品的开发提供了技术基础。