安神方颗粒对CUMS大鼠递质代谢与炎症反应的影响
2019-05-10聂玲辉黄杰聪谢炜伍志勇
聂玲辉, 黄杰聪, 谢炜, 伍志勇
(1.广东省第二人民医院 传统医学与运动伤害康复研究所, 广东 广州 510317;2.广州市从化区中医院, 广东 广州 510990; 3.南方医科大学中医药学院, 广东 广州 510515)
抑郁症以显著而持久的心境低落为主要临床特征,发作时常伴思维迟缓、意志活动减退等表现,甚至出现食欲减退、体质量减轻等躯体化症状.WHO在2017年最新发布的报告中指出,全球抑郁症患者约有3.22亿,患病率为4.4%,我国抑郁症患病率约为4.2%[1-2],且到2020年抑郁症将成为第2大致残疾病[3].抑郁症病因复杂,涉及多种发病机制,主要包括单胺类神经递质假说、下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴亢进假说、脑内神经营养因子假说、氧化应激假说等.近年来研究发现神经-内分泌-免疫网络可破坏机体的机能,并参与抑郁症的发生发展[4].抑郁症属于中医“郁病”范畴,其病因病机主要与肝气郁结有关.陈宝田教授[5]根据其50年的临床经验,认为情志相关疾病应从心肝论治,从心肝论治治疗抑郁症以通过调五脏以调情志,情志调和则肝得以正常疏泄,情志亦可舒畅,并提出安神法应作为其治疗大法.安神方颗粒(anshenfangkeli,ASF)在该理论基础的指导下应用于临床并达到显著的抗抑郁效果.然而,ASF的抗抑郁作用机理尚不清楚.本研究通过建立慢性温和不可预知应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)诱导的大鼠抑郁症模型,选取细胞因子、激素及神经递质等西医的微观指标,从多系统、多靶点、多层面来阐明中药作用于人体的整体作用,以明确ASF的抗抑郁样作用及其机制.
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级雄性Wistar大鼠30只,体质量(160~200)g,由南方医科大学实验动物中心提供(SCXK粤2006-0015).饲养条件:饲养环境温度为23 ℃~25 ℃,湿度为50%~60%,自由饮水和进食,适应性喂养1周后开始实验.
1.2 试剂及仪器
ASF颗粒组成:柴胡、黄芩、党参、半夏、生姜、大枣、甘草、桂枝、白芍、龙骨、牡蛎、枣仁、远志、合欢皮、夜交藤(由南方医院提供).大鼠GAPDH抗体(SMOBIO公司);BDNF抗体(Proteintech公司);GABAA受体α2亚基抗体(北京博奥森生物技术有限公司);Cy3标记羊抗兔IgG、FITC标记羊抗兔IgG(南京凯基生物科技发展有限公司);ECL化学发光液(杰贝斯生物有限公司);大鼠白细胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor ncrosis factor-α,TNF-α)酶联免疫吸附测定试剂盒(伊莱瑞特);BCA蛋白定量试剂盒(上海贝博生物有限公司);BIO-R 40型电泳仪(美国伯乐公司);Kodak2000MM型凝胶成像系统(美国柯达公司);Eoipse Ti-s型倒置显微镜(日本尼康公司).
1.3 CUMS造模及分组
30只大鼠随机分为空白组、模型组及安神方颗粒组,每组10只.除空白组外,其余各组进行慢性温和不可预知刺激(chronic unpredictable mild stress,CUMS),刺激包括:禁食24 h,禁水24 h,光照24 h,4 ℃冷水游泳5 min,潮湿垫料(200 mL水/笼,24 h),鼠笼45°倾斜(24 h),夹尾(1 min).每天随机安排1种刺激,连续2 周.后续3周进行CUMS 1 h前,安神方颗粒组每天给予安神方颗粒质量分数40 g/kg灌胃,空白组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃.
1.4 抑郁行为学观察
1.4.1 强迫游泳实验(FST)
分别于2、5周,将大鼠置于水深25 cm的游泳筒(高46 cm,直径21 cm),水温为23 ℃~25 ℃,记录大鼠在5 min内的累积不动时间.游泳完成后及时用毛巾擦干.
1.4.2 糖水偏好实验(SPT)
糖水偏好值=糖水摄入量/(糖水摄入量+蒸馏水摄入量).
1.5 标本采集与储存
各组大鼠进行旷场实验后,用戊巴比妥钠麻醉,立即取脑,冰袋上迅速分离海马,一部分立即放入液氮冻存,再放入-80 ℃低温冰箱保存,一部分放入带RNA保护液的EP管中,放入-80 ℃低温冰箱保存.每组取完整大脑半球放入质量分数为4%多聚甲醛固定,制备厚度为4 μm的石蜡切片炎症因子的测试.
1.6 海马组织中炎症因子的检测
称取各组大鼠海马,加入适量预冷生理盐水,在冰浴条件下超声粉碎,于4 ℃ 5 000×g下离心10 min,取上清,严格按照IL-1β和TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒说明书步骤检测炎症因子的含量.
1.7 免疫荧光
用质量分数为10%的水合氯醛麻醉大鼠,经主动脉灌注生理盐水并剪开右心耳,至流出液体较清亮后,用质量分数为4%多聚甲醛溶液灌注至大鼠尾巴变僵硬.断头取脑,置于质量分数为4%多聚甲醛溶液固定24 h后,依次放置于质量分数为10%、20%、30%蔗糖脱水,组织沉底后OCT包埋.切片,厚度为40 μm,贴好的切片37℃烤1 h,PBS洗5 min×3次,PBS洗5 min×3次,加入质量分数为5%牛血清蛋白(BSA)封闭1 h,加入一抗;空白组以PBS代替一抗.4 ℃冰箱孵育过夜,滴加免疫荧光二抗,避光孵育1 h.滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI) 5 min,PBS洗5 min×3次,封片,倒置荧光显微镜下观察结果.运用Imagepro-plus图像处理软件系统分析.
1.8 Western Blotting
用RIPA裂解液和甲苯基酰氟(PMSF)提取海马总蛋白;BCA法测定总蛋白质量分数;制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)凝胶,120 V电泳1.5 h,90 V转膜90 min,质量分数为5%脱脂牛奶室温封闭1 h,洗膜缓冲液(TBST)洗涤3次后,加一抗4 ℃摇床孵育过夜,TBST洗涤3次后,加入二抗室温孵育1 h,洗涤3次后经ECL发光液显影,分别运用成像系统和Imagepro-plus采集、分析图像.以GAPDH为内参,计算BDNF和GABAARα2蛋白的相对表达量.
1.9 统计学分析
2 结果
2.1 安神方颗粒对慢性应激抑郁模型大鼠体质量增加的影响
干预2周CUMS刺激后,模型组和安神组间大鼠体质量变化无统计学差异(P>0.05),较空白组体质量均增加缓慢(P<0.01).治疗3周后,模型组大鼠体质量增加较空白组缓慢(P<0.01);安神方颗粒组大鼠体质量增加较模型组快(P<0.01,表1).
表1 安神方颗粒对慢性应激抑郁模型大鼠体质量增加的影响
组别n2 周5周空白组1059.01±17.1473.12±20.51模型组1036.31±12.831)42.42±16.431)ASF组1033.62±14.911)59.81±18.452)
1)P<0.01 与空白组比较; 2)P<0.01与模型组比较.
2.2 安神方颗粒对慢性应激抑郁模型大鼠行为学的影响
进行2周CUMS刺激后,与空白组比较,模型组和安神方颗粒组大鼠强迫游泳累积不动时间均延长(P<0.01),糖水偏好值均减少(P<0.01);模型组和安神方颗粒组大鼠强迫游泳累积不动时间、糖水偏好值无统计学差异(P>0.05).治疗3周后,模型组大鼠强迫游泳不动时间较空白组延长(P<0.01),糖水偏好值明显减少(P<0.01);安神方颗粒组大鼠强迫游泳不动时间较模型组缩短(P<0.01),糖水偏好值升高(P<0.01,表2).
组别nt强迫游泳/s糖水偏好值2周5周2周5周空白组1057.26±15.3566.12±17.560.71±0.090.79±0.1模型组1089.61±21.201)111.32±28.421)0.50±0.081)0.44±0.051)ASF组1091.37±19.611)79.35±21.822)0.49±0.081)0.69±0.072)
1)P<0.01与空白组比较; 2)P<0.01与模型组比较.
2.3 各组大鼠海马炎症因子的质量分数比较
给药3周后,模型组大鼠的炎症因子IL-1β 的质量分数较空白组增高(P<0.01),安神方颗粒组大鼠的炎症因子IL-1β 较模型组降低(P<0.01),而且经检测炎症因子TNF-α 的质量分数,发现模型组大鼠的炎症因子TNF-α 的质量分数较空白组增高(P<0.01),安神方颗粒组大鼠的炎症因子TNF-α 较模型组降低(P<0.01,图1).
1)P<0.01 vs model; 2)P<0.01 vs control.
2.4 安神方颗粒对慢性应激抑郁模型大鼠海马BDNF和GABAARα2表达的影响
与空白组比较,模型组大鼠海马BDNF和BGABAARα2表达水平降低(P<0.01,P<0.01);与模型组比较,安神方颗粒组大鼠海马BDNF和GABAARα2表达水平升高(P<0.01,P<0.01,图2).
2.5 免疫荧光染色
本实验结果显示,各组大鼠海马CA1区和齿状回均有不同程度BDNF、GABAARα2阳性表达.与空白组比较,模型组大鼠马CA1区和齿状回BDNF、GABAARα2阳性细胞数较少;与模型组比较,安神方颗粒组大鼠海马CA1区和齿状回BDNF和GABAARα2阳性细胞数明显增多(图3、图4).
1)P<0.01 vs control; 2)P<0.01 vs model.
图3 各组大鼠海马齿状回BDNF和GABAARα2阳性表达
Fig.3 Expression of BDNF and GABAARα2 in the dentategyrus region of rats in different groups observed by immunofluorescence (×200).
图4 各组大鼠海马CA1区BDNF和GABAARα2阳性表达
3 讨论
抑郁症是一种患病率高、致残性高、负担性高的疾患,为困扰全球人类健康的严重问题[7-8].慢性温和不可预知应激(CUMS)抑郁模型能有效地模拟人们生活中遇到不可预知的刺激,是公认的动物抑郁模型,被广泛地用于抗抑郁药的筛选[9].本实验给予各组大鼠2周CUMS刺激后出现体质量增长缓慢,糖水消耗量减少,强迫游泳累积不动时间延长,表现出兴趣和快感下降等抑郁症状,与文献报道的一致[10],说明CUMS抑郁模型复制成功.γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)作为一种重要的抑制性神经递质,与相应的GABA受体(GABAAR)结合而产生的递质代谢在抑郁症发病机制中发挥着重要调控作用.GABAAR作为脑内最重要的抑制性受体,其α2亚基是GABAAR重要组成部分,通过激活GABAARα2可产生抗抑郁的作用[11].研究表明GABAARα2基因敲除小鼠在新奇事物摄食实验、强迫游泳实验和悬尾实验中表现出焦虑、抑郁样行为[12].同时GABAAR及脑源性神经营养因子(brain-derived neurophic factor,BDNF)表达的异常共同参与了抑郁症的病理生理过程[13-14].而BDNF的释放与GABAAR有关.激活GABAAR可引起电压门控钙离子通道(voltage-gated Ca2+channels,VGCCs)开放,增加Ca2+内流,使神经元去极化,引起Ca2+依赖的BDNF释放;而BDNF/rkb信号通路可以抑制GABAAR的內吞和增加其在细胞表面的表达[15].因此与递质代谢有关的GABAAR与BDNF/Trkb信号通路可形成正反馈调控机制,共同调节神经元的增值、迁移、分化及突触的可塑性[16],以参与抑郁症的发生发展.
有研究表明神经递质代谢紊乱是由细胞因子水平紊乱引起,从而引发抑郁;反之,当患上抑郁症后神经递质下降又可引起患者的免疫功能紊乱而导致细胞因子分泌异常的表达[17].细胞因子是一类蛋白质或小分子多肽,在人体中具有调控免疫应答生物活性的能力,属于调控人体神经-免疫-内分泌网络的重要因子.临床上抑郁症患者血液检测发现IL-1β水平普遍升高[18].小鼠经过慢性温和应激后,其IL-1β表达水平在外周及中枢海马区明显升高,而且出现行为学呈抑郁样改变,但是如果对IL-1受体敲除小鼠应用同样的应激方式,则不能引起其抑郁样行为学改变[19]. 有研究提示TNF-α和IL-1β可以调节5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的摄取,通过激活丝裂原活化蛋白激酶,催化一系列级联反应,最终使5-HT的再摄取增加,减少5-HT的浓度[20],而5-HT的浓度降低,最终会诱发焦虑抑郁.既往研究证实 GABA 可通过 GABABR 和 GABAAR 调节中缝背核5-HT水平[21],由此可得出,炎症因子IL-1β及TNF-α可诱发的抑郁症可能与GABABR有关.本研究通过CUMS构建的抑郁症动物模型,其炎症因子IL-1β及TNF-α 的水平较空白组增高.本实验应用免疫荧光和Western blotting技术检测各组大鼠海马BDNF和GABAARα2的表达,结果显示模型组大鼠海马BDNF和GABAARα2表达较空白组明显减少.以上研究表明,慢性应激可以通过下调海马BDNF和GABAARα2的表达从而介导抑郁的发生,而且其发生过程与炎症反应有关.
抑郁症属于中医“郁病”范畴,其病因病机主要是肝气郁结.陈宝田教授(全国名老中医,将军教授)从医50载,在临床诊治抑郁症方面积累了丰富的临床经验,陈老认为情志相关疾病应“从心肝论治”,并提出:除中医八法之外,还应当将安神法作为中医治法的另一治疗大法.心为君主之官,主血脉和神志,司五脏六腑之主,心神明则脏腑安,心动则五脏六腑皆摇;同时心亦主身之血脉,诸血皆归入心,肝藏血,主疏泄,调节精神情志.安神法通过调五脏以调情志,情志调和则肝得以正常疏泄.安神方颗粒是根据此理论而创立的,方中小柴胡汤,疏肝解郁,调节情志;桂枝、芍药调和阴阳;龙骨、牡蛎、酸枣仁、合欢皮、夜交藤宁心安神,全方共凑疏肝解郁、宁心安神之效,该方临床上治疗抑郁症取得了良好的效果.本研究结果显示,造模成功后予以安神方颗粒进行治疗,大鼠体质量增长较快,糖水消耗量增加,强迫游泳累积不动时间缩短,提示安神方颗粒具有良好的抗抑郁作用.与模型组比较,安神方颗粒组大鼠海马炎症因子IL-1β及TNF-α的水平均降低,而且BDNF和GABAARα2的表达明显上升,推测安神方颗粒可通过上调BDNF和GABAARα2的表达从而发挥抗抑郁的作用,其发挥抑郁治疗作用与炎症反应有关.由此可见,安神方在疏肝解郁、宁心安神的治疗方法指导下,通过多途径、多靶点、多层面干预细胞因子、激素、神经递质而发挥抗抑郁的作用,这为临床使用安神方颗粒治疗抑郁症提供了有力实验依据.