成都地区猫传性腹膜炎病毒ORF3、7b以及S基因七肽重复区1序列的分析

2019-05-10吴春霞卢建远金素钰郑玉才

中国预防兽医学报 2019年2期

吴春霞，卢建远，金素钰，黄林，郑玉才

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041)

猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)属于冠状病毒亚科α-冠状病毒属[1]，其基因组两个大的开放阅读框ORF1a和1b(占基因组2/3)与复制有关；ORF2、4、5和6分别编码结构蛋白S、E、M和N[2]；ORF3和7分别编码非结构蛋白3a、3b和3c以及7a 和 7b[3]。

FCoV分为猫肠道冠状病毒(Feline enteric coronavirus，FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus，FIPV)[4]。FECV在猫中普遍存在，并在其肠上皮细胞中复制，感染呈无症状或轻微的肠炎。感染FCoV后大约有5%～10%的2岁以下猫发展成猫传染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis，FIP)。研究表明，FIPV由FECV突变而来，它能够在巨噬细胞中高效复制，是导致家猫死亡的主要病毒[5]。

FCoV研究中最重要的问题之一是FCoV与FIPV之间的关联尚不清楚。序列分析表明，FIP患猫的ORF 3c基因常出现截短[6]，而7b基因是FCoV的毒力基因，完整的3c基因可以阻止7b基因编码的毒力[7]。另外，S基因融合肽区的1045位氨基酸是鉴别FIPV的研究热点，该区包含了病毒侵入时病毒与细胞膜融合的关键成分[8]。FCoV基因组序列变异很大[3]，但相关研究国内很少。为了检测其序列特征进而寻找其致病的关键靶点，本研究对来自成都地区的11只FIP患猫的腹水样品进行了FCoV非结构蛋白基因和S基因七肽重复区(Heptad repeat region，HR)1序列的研究。

1 材料与方法

1.1 病料样品来源 11例腹水取自西南民族大学动物医院2017年9月～2018年3月接诊的有腹部积液、黄疸等FIP症状的猫，样品于-80℃保存。11只猫均在1岁以下。利用文献中发表的检测FIPV的引物[1]证实11例样品为FIPV阳性。

1.2 主要试剂 PureLinkTMViral RNA/DNA mini Kit和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；MIX Green酶购自北京擎科新业生物技术有限公司。

1.3 RNA的提取及cDNA的合成参照PureLinkTMViral RNA/DNA mini Kit说明书，提取猫腹水中总RNA，按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书方法反转录，获得cDNA。

1.4 ORF3、7b以及S基因HR1序列的扩增参照文献[1]合成PCR引物，以1.3获得cDNA为模板利用套式PCR扩增ORF3。7b基因[3]及S基因HR1序列[1]采用普通PCR扩增，反应体系和条件与第一轮扩增ORF3类似，只是采用相应的引物和退火温度。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR阳性产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果利用BLAST和DNAMAN(V6版)软件分析。利用MEGA7软件，参照GenBank中相关基因序列(EU186072等)建立进化树，分析不同腹水样品检测到的病毒基因的遗传变异。

2 结果与讨论

2.1 FIPV部分基因的扩增结果利用PCR对FIRV ORF3、7b和S基因HR1区域进行扩增，结果显示扩增出特异性的目的片段，大小与预期相符(图1)。11个样品全部扩增得到7b基因和S基因HR1序列片段，9个样品扩增得到ORF3基因。未能扩增到ORF3的两个样品可能是由于突变过高导致引物不适用引起。

图1 FIPV ORF3、ORF7b及S基因HR1区域的PCR扩增Fig.1 Amplifications of ORF 3,ORF 7b and HR1 of S gene of FIPV by PCR

2.2 ORF3的序列分析与参考株(EU186072)序列比对，扩增得到的FIPV的ORF3a由于核苷酸缺失，导致9个样品中FIPV均存在1个Phe缺失；9个样品病毒的ORF3b基因的核苷酸存在突变，但不引起编码氨基酸数量(72aa)的改变；ORF3c由于核苷酸缺失，导致推导氨基酸不同程度截短(13aa～130aa)，仅1个样品(FIPV/SWU-CD-11/2018)的FIPV显示具有完整的3c基因(表1)，ORF3C出现截短的比例约为89%(8/9只猫)。

FCoV本身是否直接导致FIP目前尚不清楚。有报道显示，完整的3c基因是FCoV在肠道中有效复制的关键，但对FIPV的复制不重要[9]。本研究中高比例样品的3c基因存在氨基酸的截短，正是由于这一改变，使得仅在肠道复制的FCoV脱离肠道，在巨噬细胞中复制并传播，从而使猫出现致死性的FIP[1]。

表1 FIPV 3c基因序列的变化Table 1 Variation of FIPV 3c gene sequence

2.3 7b基因的序列分析将11个样品扩增得到的FIPV 7b基因与参考株(EU186072)的相应基因核苷酸和氨基酸序列比对后显示，7b基因与参考株的核苷酸同源性为88.73%～91.30%，推导氨基酸序列同源性为85.44%～90.78%，突变位点有13～30个。3只猫在肽链N-末端附近缺失1个氨基酸。所有样品在7个位点(第33、63、64、76、139、157和189位)出现氨基酸的全部替换，而其它突变位点仅少数氨基酸变化，这与FCoV的高突变率有关。

根据获得的7b基因序列和GenBank中几个FIPV的7b基因序列构建系统发育树(图2A)，其中FIPV/SWU-CD-2/2018、FIPV/SWU-CD-3/2018 和 FIPV/SWU-CD-4/2018处于同一遗传进化分支，并与Hungary FIPV JQ40891和UK FIPV FJ943764亲缘关系最近。FIPV/SWU-CD-5/2018自成一小分支，与UK FIPV FJ943764和Germany FIPV KJ665801亲缘关系最近。所有的基因序列均处于同一大的遗传进化分支，表明本实验所得的7b基因序列与国外报道的相应基因序列的亲缘性较高。

研究指出，FCoV的毒力由3c和7b基因互作决定[10]。完整的3c基因可以抑制7b基因编码的毒力[9]，本实验中91.67%的FIPV 7b基因完整，而89%FIPV的3c基因截短，推测二者共同作用提高了FCoV的毒力，导致猫患FIP。

2.4 S基因HR1序列的分析与参考株(EU186072)S基因HR1序列比对显示，本研究中1只猫的FIPV S基因HR1序列在末端缺失了7aa，其原因尚不清楚，也未见类似报道，其余10只猫FIPV S基因HR1区域序列完整。本实验所得S基因HR1序列与参考株的相应核苷酸相似性为85.93%～89.51%，氨基酸相似性为92.48%～97.37%。所有样本获得的FIRV S基因HR1氨基酸序列，存在32处差异，单只猫的FIPV S基因HR1氨基酸序列最多有20处，最少有7处存在差异。几个位点存在氨基酸的完全替换，包括融合肽内的1045位Met与Leu的完全替换。融合肽包含了病毒入侵时病毒与细胞膜融合的关键成分，其氨基酸替换使病毒突变为毒性形式[8]。

试验所得序列和GenBank中的FIPV的S基因HR1序列构建系统发育树(图2B)。FIPV/SWU-CD-2/2018、FIPV/SWU-CD-6/2018 和 FIPV/SWU-CD-8/2018处于同一遗传进化分支，并与Japan FIPV AB088223亲缘关系最近，且与FIPV/SWU-CD-3/2018处于同一小分支。FIPV/SWU-CD-9/2018、FIPV/SWU-CD-10/2018自成一小分支，分别与Germany FIPV EU186072和UK FIPV DQ010921亲缘关系最近。所有FIPV S基因HR1序列均处于同一大的遗传进化分支，表明本实验所得FIPV S基因的HR1序列与国外报道的相应基因序列的亲缘性较高。相同实验室提交的该序列相似度极高，因此本研究中构建系统发育树时，分别选取有代表性的国外提交的基因序列。利用2个基因序列构建的系统发育树尽管不完全一致，但反应的进化关系总体相似。

目前在分子水平上FIPV与FCoV尚无明确的区别[11]。在Bankwolf等人的试验中，9/12只FIP猫的S蛋白1045位Met被Leu替换[1]，在Chang等人的试验中，92%的FIP患猫的S蛋白1045位Met被Leu替换[12]，本研究中该位点所有Met均被Leu替换。S蛋白在细胞进入过程中起重要作用，负责受体附着和细胞膜融合，该区氨基酸的替换会导致病毒的嗜性改变，使病毒得以从肠道逃逸至巨噬细胞中复制，从而使猫患FIP[12]。

本研究结果表明，从FIP患猫分离所得的FIPV的ORF3、7b以及S基因HR1序列与国外报道的几个FIPV相应基因片段有较近的亲缘关系，其非结构蛋白基因编码的氨基酸序列存在很大的个体间差异，3c基因普遍存在高比例的、不同程度的截短，而3a和3b基因主要表现为氨基酸突变；7b基因和S基因HR1序列中均有一些位点的氨基酸被一致性替换。推测3c基因的截短和7b及S基因某些氨基酸的替换会增强病毒的毒性而引起FIP。