重组腐败梭菌α毒素的制备与免疫效力评价

彭国瑞，彭小兵，李旭妮，董令赢，蒋玉文

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

快疫(Braxy)是羊的一种多发、非接触、急性和致死性传染病，其病原腐败梭菌(Clostridium septium)可以产生α、β、γ和δ4种外毒素[1-2]，其中α毒素是该病主要的致死性毒力因子和免疫保护性抗原[3-4]。因快疫发病急，往往来不及治疗即发生死亡，因此免疫接种是预防该病最有效的途径之一，我国主要采用羊快疫、黑疫二联灭活疫苗；羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗及羊梭菌病多联干粉灭活疫苗等预防，然而这几种疫苗的检验合格率并不高[5]，存在免疫效果不确实的问题。美国和欧洲除了灭活菌苗外还有类毒素疫苗，诸多研究表明，将腐败梭菌α毒素制成类毒素免疫动物，可抵抗不同型腐败梭菌及孢子的攻击[6]，利用基因工程技术制备的重组α毒素对火鸡[7]和小鼠均具有免疫保护作用。本实验以表达重组腐败梭菌毒素的大肠杆菌pET28a-CSA/BL21[8]为研究对象，经诱导表达后，将其制成灭活疫苗，探究不同表达形式重组蛋白、裂解处理等对免疫效力的影响，为羊快疫疫苗的研制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 腐败梭菌C55-1株(CVCC60021)、腐败梭菌抗毒素羊血清由本实验室制备并保存；表达腐败梭菌α毒素的E.colipET28a-CSA/BL21由本实验室构建[8]；兔抗羊HRP-IgG购自Sigma公司；LB肉汤、TG培养基、TSB培养基、厌气肉肝汤和胰酶消化汤等由北京中海公司提供；氢氧化铝胶佐剂由中牧实业有限公司兰州生物药厂提供。体质量为16 g～18 g ICR小鼠、2 kg日本大耳白家兔购自北京维通利华实验动物公司。

1.2 重组α毒素表达条件的优化 将E.colipET28a-CSA/BL21接种LB肉汤，37℃ 260 r/min震荡培养，用对诱导时菌液OD600nm、诱导温度、诱导剂IPTG浓度以及时间等条件进行优化。用SDSPAGE检测，Quantity One 4.6.2软件分析表达量。

1.3 重组α毒素表达形式分析 以优化后的条件诱导工程菌表达后，离心沉淀复溶，冰浴超声波裂解，4℃12 000 r/min离心1 mim，分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE分析抗原的表达形式。以腐败梭菌抗毒素羊血清(1∶25)为一抗，兔抗羊HRP-IgG(1∶800)为二抗western blot检测重组蛋白的反应原性[9]。

1.4 腐败梭菌毒素的制备 参考中国兽药典羊快疫疫苗效力检验所使用毒素的制备方法，将腐败梭菌C55-1株接种于厌气肉肝汤培养基，37℃静置厌氧培养24 h，转接胰酶消化汤37℃静置厌氧培养24 h，离心取上清，0.22μm滤器过滤除菌即得腐败梭菌毒素，-80℃低温保存备用。

1.5 疫苗的制备 将诱导后的pET28a-CSA/BL21超声波裂解上清(可溶性抗原)、裂解沉淀悬液(包涵体抗原)和超声波裂解诱导后的全菌菌液以及未经裂解处理诱导后的全菌菌液分别加入0.2%甲醛，1.4制备的腐败梭菌毒素加0.7%甲醛用于类毒素疫苗制备[10]，密封，37℃灭活，每天轻摇4～5次，3 d后进行灭活检验(检验方法：0.40 m L/只腹腔注射小鼠2只，观察24 h，如有死亡继续灭活)。灭活完全后加20%灭菌氢氧化铝胶混匀后备用。

1.6 疫苗的无菌检验与安全检验 对所制备的各类疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》规定的方法进行无菌检验。各类疫苗分别以5.0 m L/只皮下注射家兔各4只，观察10 d，应全部健活，则安全检验合格。

1.7 疫苗免疫效力评价

1.7.1 不同表达形式抗原对疫苗免疫效力的影响将可溶性的重组腐败梭菌α毒素疫苗、重组腐败梭菌α毒素包涵体疫苗以及腐败梭菌类毒素疫苗分别以1.0 m L/只经颈背部皮下注射免疫家兔各5只，对照组5只不免疫。血清中和抗体效价的测定：免疫后第14 d经耳中央动脉采血，分离血清，将同组内血清等量混合制成混合血清，将经过适当稀释的腐败梭菌毒素与混合血清2∶1混匀，37℃孵育40 min，0.30 m L/只尾静脉注射小鼠各2只，观察3 d，直到血清刚好能中和毒素。攻毒保护试验：各组家兔免疫24 d后，全部经耳缘静脉注射1.4制备的1 MLD腐败梭菌毒素，观察各组家兔死亡情况，共观察5 d。

1.7.2 裂解处理对全菌疫苗免疫效力的影响分别用经超声波裂解处理和未经裂解处理诱导后的全菌灭活疫苗1.0 m L/只颈背部皮下注射免疫家兔各4只。同1.7.1测定血清中和抗体效价并攻毒。

2 结果

2.1 重组α毒素表达条件的优化 对诱导时pET28a-CSA/BL21菌液OD600nm、诱导温度、IPTG浓度以及诱导时间等条件进行优化。结果显示，培养约4 h菌液OD600nm在0.850～0.950达到细菌生长对数生长中后期时，加IPTG至0.40 mmol/L，37℃诱导6 h，重组α毒素表达量较高，为菌体总蛋白的25.0%(图 1)。

2.2 重组α毒素表达形式分析 诱导后的重组菌液经超声波裂解处理，SDS-PAGE结果显示在52 ku处有特异性目的条带，与预期大小相符。特异性条带的相对表达量为25%，绝对表达量为0.56mg/m L菌液。在菌液离心上清中未检测到特异条带，重组菌裂解上清中重组α毒素含量低于沉淀中的重组α毒素(图1A)。结果表明，重组α毒素以包涵体和上清分泌2种形式表达，包涵体含量高于上清中的含量。Western blot结果显示，在52 ku处有特异条带，与预期相符(图1B)，表明重组蛋白与腐败梭菌抗毒素血清有较好的反应原性。

2.3 疫苗的无菌检验与安全检验 制备的各类疫苗接种TG和TSB培养基后均无菌生长；家兔5.0m L/只接种疫苗后，在观察期内均全部健活。表明所制备的疫苗无菌检验和安全检验合格，可以用于后续免疫效力评价。

2.4 疫苗的免疫效力评价 家兔免疫可溶性疫苗、包涵体疫苗、类毒素疫苗以及裂解和未经裂解诱导后的全菌疫苗14 d后测定其血清中和抗体效价，21 d后用腐败梭菌毒素攻毒。结果显示，类毒素疫苗组家兔混合血清中和抗体效价为1 MLD/0.1m L，包涵体疫苗组为6 MLD/0.1 m L；可溶性疫苗组、裂解菌苗组和未裂解菌苗组均为8 MLD/0.1 m L；攻毒后类毒素疫苗组保护率为2/5，其余疫苗免疫组均全部保护，对照组全部死亡(表1)。结果表明，可溶性疫苗、裂解和未经裂解全菌疫苗免疫效力相近且高于包涵体疫苗，其中可溶性疫苗免疫效率最高，且上述疫苗免疫效力均高于类毒素疫苗。

图1 重组α毒素表达形式的SDS-PAGE分析(A)和western blot鉴定(B)Fig.1 Analysis of recombinant alpha toxin expression by SDS-PAGE(A)and western blot(B)

表1 重组腐败梭菌α毒素免疫家兔的攻毒保护试验Table 1 Immunoprotection of the rabbits immunized with recombinant alpha toxin of C.septicum

3 讨论

现行《中华人民共和国兽药典》规定含有羊快疫病原组分的三联四防灭活疫苗效力检验按照血清中和法和免疫攻毒法任择其一，而且在免疫攻毒法中既可以攻腐败梭菌菌液也可以攻毒素。本实验采用血清中和法对疫苗免疫效力评价结果显示，免疫重组腐败梭菌α毒素疫苗的家兔血清中和抗体效价均高于类毒素疫苗组和《兽药典》规定的1 MLD/0.1m L；免疫攻毒法对疫苗免疫效力的评价结果显示，各重组腐败梭菌α毒素疫苗组全部保护，类毒素疫苗组保护率仅为40%，对照组全部死亡。其中类毒素疫苗效力评价结果与彭小兵[5]等报道相近，血清中和抗体效价为1 MLD/0.1 m L时不足以使家兔抵抗1MLD的毒素攻击。

本实验中可溶性疫苗与包涵体疫苗相比前者重组α毒素含量较低，但免疫效力却没有因此降低，二者均诱导家兔产生了很好的免疫应答，而且可溶性疫苗免疫家兔血清中和抗体效价高于包涵体疫苗，分析认为可溶性抗原能够形成更完整的空间结构，因此免疫效率更高。尽管全菌疫苗含有包涵体和可溶性两种疫苗抗原量之和，试验结果也显示全菌疫苗免疫家兔血清中和抗体效价较包涵体疫苗组更高，但却与可溶性疫苗组效力相当，进一步表明可溶性疫苗免疫效率最高。诱导后的全菌裂解处理是否有利于有效抗原和可溶性抗原的释放，进而诱导机体产生更强的免疫应答？结果显示裂解处理与否其免疫攻毒保护和血清中和抗体效价测定结果相近。为获得更为确切的结果，则需要测定最低免疫剂量，再进行比较免疫效果的试验。

值得一提的是，本实验未经裂解处理的全菌灭活疫苗以含重组α毒素0.45 mg的剂量免疫家兔即可实现较好的免疫效果，其具有抗原含量高，制备步骤少便于生产推广，且有利于降低内毒素的释放等优点；同时，Ferreira等报道产气荚膜梭菌采用基因工程菌苗可以克服亚单位疫苗分子量小的不足，而菌体能够发挥佐剂作用提高机体的免疫应答，增强了疫苗的免疫效果[11]，由此推测腐败梭菌基因工程全菌苗也可能具有这样的作用。安全性方面考虑，大肠杆菌基因工程菌具有很好的安全性而广泛应用，且采用甲醛灭活的方法既能够使重组毒素脱毒又可以将工程菌灭活保证了转基因生物安全，因此，基因工程全菌灭活苗不失为一种预防羊快疫的候选疫苗。综上，含重组腐败梭菌α毒素的基因工程疫苗具有很好的安全性和免疫保护效果。