豪猪源福氏志贺菌的分离鉴定及喹诺酮类耐药基因检测

张鹏飞，王 印,2*，德西措姆，杨泽晓,2，姚学萍,2，罗 燕,2，廖倡宇,2

(1.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130；3.西藏昌都市左贡县畜牧站，西藏 昌都 854499)

豪猪(Hystrix hodgsoni)属啮齿目、豪猪亚目、豪猪科，具有食用、药用、观赏价值，素有动物人参的美称。我国颁布的《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》中将豪猪列为保护物种，禁止捕猎，可人工驯养繁殖。国民生活水平的提高和农业产业化结构的调整，极大地推动了豪猪养殖业的发展。

志贺菌属细菌可以引起人兽细菌性痢疾，具有高度传染性且死亡率较高。人和动物感染该菌后，临床主要表现为腹痛、水样泻，严重者可见神经症状并伴肺炎、败血症[1]。该菌的感染对全球，特别是发展中国家的人群(尤其是儿童)造成了严重危害，志贺菌可感染的动物包括：猕猴[2]，牦牛[3]，牛[4]，鸡[5]，羊[6]等，并且近几年关于动物感染该菌的报道不断增多。同时，志贺菌是继沙门菌、大肠杆菌O157∶H7后的世界第三大食源性致病菌，造成严重的食品卫生安全隐患。志贺菌分为痢疾志贺菌、宋内志贺菌、鲍氏志贺菌和福氏志贺菌4个血清群，我国流行菌株以福氏志贺菌为主。喹诺酮类药物是治疗菌痢的首选药物，但近年来福氏志贺菌对该类抗生素的耐药率不断提高，耐药性严重，给临床治疗带来极大挑战。对喹诺酮类药物的耐药性主要与该菌DNA促旋酶Ⅱ和拓扑异构酶Ⅳ的喹诺酮耐药决定区QRDR(Quinolone resistance-determining region)发生突变有关，此外相关耐药机制还包括主动外排系统和质粒介导[7]。

2018年4月，四川省某规模化豪猪养殖场发生腹泻疫情，哺乳豪猪发病率达100%，死亡率50%以上；同时成年豪猪也出现发热和腹泻症状。剖检死亡豪猪可见肠道水肿充血，肠系膜高度充血，肠内黄色水样内容物；全身脏器不同程度出血，以肺脏尤为严重，根据临床症状和剖检病变初诊为细菌性痢疾，并且据畜主陈述使用抗生素治疗未取得明显的效果。因此，为明确此次细菌性痢疾疫情发生与治疗失败的原因，本研究拟通过细菌分离纯化、培养特性观察、染色镜检、生化鉴定和16S rRNA基因克隆测序确定分离所得菌株，分析分离株致病力、测定其耐药谱，并对分离株的喹诺酮耐药基因进行了PCR检测和测序分析。为豪猪养殖业和其它经济动物养殖业中福氏志贺菌的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料样品、实验动物与主要试剂 3头哺乳期病死豪猪来自四川省乐山市某规模化养殖场；SPF级昆明小鼠12只，体质量为18 g～20 g，雌雄各半，购自成都达硕生物科技有限公司；胰酪大豆蛋白胨琼脂培养基(TSA)、麦康凯(MAC)琼脂培养基、三糖铁(TSI)琼脂培养基、志贺菌属琼脂培养基(SS)购自成都万科生物技术有限公司；抗菌药物药敏纸片、细菌微量生化反应管购自杭州微生物试剂有限公司；pMD19-T(simple)载体购自TaKaRa公司；大肠杆菌 DH5α、2×TaqPCR Master MIX、DNA 分子量标准、细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 引物的设计与合成 参照文献[8-9]设计细菌16S rRNA基因通用引物P1/P2、DNA促旋酶Ⅱ喹诺酮耐药决定区(gyr A)、拓扑异构酶Ⅳ喹诺酮耐药决定区(parC)、质粒介导喹诺酮耐药基因qnrA、qnrB、qnr S的PCR扩增引物P3～P12(表1)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，稀释至10μmol/L，-20℃保存备用。

1.3 细菌的分离、纯化及培养特性观察 解剖死亡豪猪，无菌取肺脏组织、肠道内容物分别划线接种于Mac琼脂培养基和SS琼脂培养基，37℃培养24 h后挑取2个以上可疑菌落分别接种TSI、葡萄糖半固体和营养琼脂斜面各1管，培养后观察结果。疑似菌株经纯化后进行革兰染色镜检。

1.4 分离菌的生化试验 挑取纯化后的单个菌落接种于细菌微量生化反应管，于37℃培养24 h后，参考GB 4789.5-2012《食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验》判定结果。

表1 实验用引物序列Table 1 Primer sequences used in this experiment

1.5 16S rRNA基因的扩增及序列分析 提取分离株基因组DNA进行PCR扩增，扩增体系50μL：2×TaqPCR Master 25.0μL，RNase-free H2O 20.0μL，上下游引物各1.5μL，基因组模板2.0μL。反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃1 min，30个循环；72℃10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的片段，由华大科技有限公司测序。

1.6 药敏试验 采用纸片扩散法进行药敏试验，参照CLSI标准判定试验结果。

1.7 小鼠致病性试验 利用无菌生理盐水冲下过夜培养的菌落，菌液浓度调至1×108cfu/m L。12只小鼠随机分为2组，实验组小鼠腹腔注射0.2 m L菌液，对照组小鼠腹腔注射0.2m L生理盐水。感染后连续观察7 d，剖检死亡小鼠，按照1.3进行细菌的分离鉴定。

1.8 喹诺酮耐药基因的PCR检测及序列分析 采用细菌基因组提取试剂盒提取分离菌株基因组DNA作为模板，进行喹诺酮耐药基因gyr A和par C的PCR检测；挑取经纯化的菌落，溶于100μL RNase-free H2O，经煮沸离心后，以上清液作为DNA模板，进行质粒介导耐药基因qnr A、qnr B、qnr S的PCR检测。反应条件：94℃5 min；94℃30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，30个循环；72℃10 min。gyr A与par C基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的片段，由华大科技有限公司测序，测序结果经Blast对比分析。

2 结果与讨论

2.1 分离菌株生长特性及形态观察 按照1.3操作从3头病死豪猪体内分别分离纯化到1株革兰阴性菌，3株分离菌株在MAC琼脂培养基上生长为粉红色、光滑、湿润、圆形、边缘整齐的中等大小菌落；在SS琼脂培养基上为无色菌落；在TSI中斜面产碱(红色)、底层产酸(黄色)、不产气、不产H2S、在葡萄糖半固体培养基中无动力。表明3株分离菌发酵葡萄糖，不发酵乳糖和蔗糖，表现出相同的培养特性，结合上述结果初步判定分离菌株应属埃希菌属、志贺菌属或沙门菌属其中之一。

2.2 生化特性鉴定 生化鉴定结果显示，3株分离菌不能分解尿素、水杨苷、七叶苷、甘油，β-半乳糖苷酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶试验阴性，可发酵棉子糖和甘露醇，迟缓发酵靛基质。参考GB 4789.5-2012《食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验》分析，3株分离菌均符合福氏志贺菌的生化特性。

2.3 16S rRNA基因的扩增与序列分析 通用引物P1/P2分别扩增3株分离菌16S rRNA基因，琼脂糖凝胶电泳结果显示，均在约1 500 bp处有一特异性条带。测序结果经Blast比对分析，显示3株分离菌的16S rRNA基因序列一致性为99%，并且与福氏志贺菌的16S rRNA基因序列同源性为99%，结合培养、染色特性和生化特性鉴定结果判定分离菌株为福氏志贺菌，在肺脏和肠道样品中均有存在，确定此次豪猪腹泻疫情由该菌感染所致。推测该菌的致病过程，可能为：细菌在肠道定植后，穿过消化道黏膜(通过胞吞或穿过细胞间隙)随血流分布到肠道外各器官，引发全身感染，患病豪猪最终死于脱水导致的代谢性酸中毒和败血症。

2.4 药敏试验结果 药敏试验结果显示，在所测试的药物中，分离菌株仅对丁胺卡那敏感，对其它所测抗生素均表现为耐药(表2)。这与临床使用喹诺酮类等抗生素无法控制疫情的情况相符合。

2.5 小鼠致病性试验 小鼠随机分为2组，实验组小鼠腹腔注射分离菌株纯培养物，对照组注射生理盐水，连续观察7 d。实验组小鼠在感染6 h后，开始表现精神不振、被毛粗乱，采食和饮水量均有下降，在感染24 h内全部死亡。剖检死亡小鼠可见，肺脏和肝脏出血，肠道水肿充血。从死亡小鼠病变组织分离所得菌株，经革兰染色镜检、培养特性观察、生化试验鉴定和16S rRNA基因序列测序分析，确定为福氏志贺菌，且各项试验结果与豪猪病变组织中分离得到的菌株一致。对照组小鼠未见发病或死亡。

表2 分离株药敏试验结果Table 2 Antimicrobial susceptible tests of the isolate

2.6 喹诺酮耐药基因的PCR检测及测序分析 采用特异性引物分别扩增分离菌株喹诺酮耐药基因gyr A、par C、qnr S、qnr B、qnr A。结果显示，gyr A、par C、qnr S、qnr A基因扩增均为阳性，分别约为 300 bp、400 bp、550 bp、600 bp；qnr B基因扩增阴性(图1)。将gyr A、par C基因测序结果分别与喹诺酮类抗生素大肠杆菌敏感株的gyr A(X06744)、par C(M 58408)基因序列进行比对。结果显示，分离菌株gyr A基因存在C→T导致的83位TCG(Ser)→TTG(Leu)的突变；G→A导致的87位GAC(Asp)→AAC(Asn)的突变；85位 GTC→GTT、91位CGC→CGT、100位TAT→TAC导致的沉默突变。分离菌株par C基因存在G→T导致的58位AGC(Ser)→ATC(Ile)的突变；69位 CAA→CAG导致的沉默突变。

图1 分离株喹诺酮耐药基因PCR扩增结果Fig.1 Amplification for quinolone resistance gene of the isolate by PCR

喹诺酮类抗生素是目前治疗菌痢的首选药物，该类药物通过作用于细菌的拓扑异构酶Ⅱ和Ⅳ，干扰细菌DNA复制、修复及转录而杀菌。但多年的临床应用导致志贺菌对喹诺酮类药物的耐药性日益严重，耐药机制主要包括：1)拓扑异构酶(Ⅱ和Ⅳ)突变；2)细胞膜孔蛋白通道改变或缺失；3)主动外排系统；4)质粒介导耐药等。其中，拓扑异构酶(Ⅱ和Ⅳ)突变是导致细菌耐药性增强的主要原因，拓扑异构酶Ⅱ(DNA促旋酶Ⅱ)的gyr A和gyr B两个亚单位是药物作用的主要靶点。在福氏志贺菌中，gyrA的突变位点集中于83位、87位、137位和211位。拓扑异构酶Ⅳ也由par C和par E两个亚单位组成，par C的突变位点集中于58位、129位、131位、134位、141位和151位[10]。本研究所得分离菌株gyr A的83位、87位和par C的58位存在突变。靶位点的突变会导致药物不能结合DNA复合体而抑制超螺旋结构的产生，因此也无法阻止mRNA结合和氨基酸合成。par C基因的突变需要在gyr A基因突变的基础上才有可能产生，两者的协同作用会提高菌株的耐药性，是目前认为福氏志贺菌对喹诺酮类药物耐药的根本因素。此外，分离菌株还携带有qnr A和qnr S两种质粒，其存在可以保护拓扑异构酶免受喹诺酮类药物的攻击，使细菌进一步产生更高水平的耐药[7]。靶位酶突变以及质粒介导所导致分离菌株对喹诺酮类药物的耐药，应该是使用该类药物无法控制该次疫情的根本原因。

本研究是国内首次关于豪猪源福氏志贺菌病的报道，为豪猪养殖业和其它经济动物养殖业中福氏志贺菌的防控及该菌耐药机制的相关研究提供了参考。