猪PBD1成熟肽基因在干酪乳酸杆菌中的表达及其抑菌活性的检测

杨兴武，郭 奎，韩昊莹，赵 宇，郑慧华，杨明凡,3，陈红英,3*

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150069；3.郑州市猪重大疫病防控重点实验室，河南 郑州 450002)

防御素(Defensins)是一类大小仅有2 ku～6 ku、富含半胱氨酸的阳离子活性肽[1]。根据半胱氨酸的位置以及二硫键的大小不同，可以分为α、β、θ及植物和昆虫防御素[2]。猪β防御素-1(porcineβ-defensin-1，PBD1)是猪体内最早发现的防御素，广泛存在于猪消化道、呼吸道、肝脏等多种组织器官，在猪先天免疫系统中起重要作用[3]。罗刚在2002年将编码PBD1成熟蛋白的基因插入原核表达载体PinPoin t TMXa-3中，并在大肠杆菌JM 109中得到表达[4]；姜丽华、江学斌等人在毕赤酵母中表达出PBD1成熟蛋白，并验证了其具有良好的抑菌效果[5-6]。

干酪乳酸杆菌是最早被广泛应用的益生菌之一，能够有效调节肠道微生物之间的平衡，增强机体的免疫力和抵抗力。其产生的非解离乳酸，对肠道致病菌尤其是大肠杆菌，具有很强的抑制作用[7]。许多学者利用基因重组技术，在菌株内转入外源基因(营养因子基因、抗性基因、酶基因等)，使其表达目的蛋白[8]，并且表达的蛋白可刺激粘膜产生免疫反应[9-11]。此外，由于乳酸杆菌仅有一层细胞膜，外源蛋白可以在信号肽的引导下直接分泌进入上清，更容易获得外源蛋白，可以直接将其添加到饲料中或者让新菌株再回到肠道内，在肠道内定居、增殖，除发挥原有的益生功能外，还能发挥外源基因的功能，达到一剂多功能的目的。因此，本研究将短小干酪乳酸杆菌信号肽(Signal peptide，SP)和PBD1成熟肽基因克隆到整合型表达载体pMJ67的Lac启动子下游，电转化干酪乳酸杆菌，通过红霉素筛选，获得稳定表达PBD1的重组干酪乳酸杆菌，为进一步研发广谱抗菌作用的微生态制剂奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 质粒和菌株 含猪PBD1全基因序列(PBD1Q)的重组质粒pMD18-T-PBD1Q和pUCK-SP均由郑州市猪重大疫病防控重点实验室构建并保存；pMJ-67(+)载体和干酪乳酸杆菌感受态细胞由本实验室保存；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自上海康为世纪有限公司。

1.2 主要试剂与培养基 PreMIX ExTaq、DNA Marker、异丙基 -β-D-硫代半乳酸酐(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷(X-gal)、T4 DNA连接酶、第一链合成试剂盒(HiFi-Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒等均购自康为世纪有限公司；小鼠抗His标签单克隆抗体(MAb)，山羊抗小鼠HRP-IgG购自TaKaRa公司；限制性内切酶NdeⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ均购自美国Thermo公司。

1.3 引物的设计与合成 根据pMD18-T-PBD1Q中PBD1Q基因序列，设计1对特异性引物P1/P2，(P1：5'-GGGGGTACCAAAAACATAGGAAATTC-3'/P2：5'-TCTTTGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGG TGCCCGCTGCCGCCGCTGCCGCCCTTCCTTTTGCA GCATTTGAC-3')，扩增编码PBD1的成熟肽基因，上、下游引物5'端分别加入KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位点，并在下游加上柔性蛋白linker(下划线部分)和6个组氨酸(his标签：斜体部分)。预期扩增片段为168 bp。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.4 整合性表达质粒pMJ67-SP-PBD1的构建

1.4.1 重组质粒pUCK-SP-PBD1的构建及鉴定利用引物P1/P2，以质粒pMD18-T-PBD1Q为模板，PCR扩增PBD1，采用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切PCR产物，电泳后回收PBD1片段，克隆至同样处理的pUCK-SP载体，构建重组质粒pUCK-SP-PBD1，并经PCR和酶切鉴定。

1.4.2 重组表达质粒pMJ67-SP-PBD1的构建及鉴定利用NdeⅠ和EcoRⅠ分别酶切pUCK-SP-PBD1和pM J67载体后将酶切产物SP-PBD1基因克隆到线性化的pMJ67载体，构建重组质粒pMJ67-SP-PBD1，并经PCR、酶切及测序鉴定。

1.5 电转化及重组乳酸杆菌的鉴定 将5μL pM J67-SP-PBD1与100μL干酪乳酸杆菌感受态细胞轻轻混匀后，转入0.1 cm的预冷电击杯中，冰浴10min，在电转仪中电击一次后立即加入900μL 10%蔗糖的MRS复苏培养基(MES、500 mmol/L蔗糖、20 mmol/L和2 mmol/L CaCl2)。然后将菌液转移到1.5m LEP管中，37℃厌氧孵育3 h，室温5 000 r/min离心5 min，弃去上清。取80μL菌液涂布于含5μg/m L红霉素的MRS固体培养板，37℃厌氧静置培养48 h。挑取单菌落接种于5 m L含5μg/m L红霉素MRS液体培养基中，37℃厌氧静置培养18 h。提取菌液基因组DNA，利用P1/P2引物，PCR扩增PBD1基因。并对PCR产物进行测序与分析。

1.6 半定量RT-PCR分析PBD1的转录水平 挑取经鉴定正确的重组猪PBD1干酪乳酸杆菌单菌落接种于5 m L含5μg/m L红霉素MRS液体培养基中，37℃厌氧静止培养18 h。取1 m L菌液，转接到50 m L含2%乳糖MRS液体培养基中，37℃厌氧分别诱导培养12 h、14 h、16 h、18 h、20 h。每个时间点各取2 m L菌液。利用总RNA提取试剂盒提取重组猪PBD1干酪乳酸杆菌总RNA，按照反转录试剂盒说明书反转录为cDNA，以其为模板利用P1/P2引物，PCR扩增PBD1基因。同时用Alphalmager HP系统软件检测不同时间点PBD1基因条带灰度值，以猪PBD1基因对内参基因(16S rRNA)的灰度值记录结果并对其进行分析。

1.7 PBD1蛋白的 western blot检测 取5 m L含重组质粒pMJ67-SP-PBD1的重组乳酸杆菌，接种至200m L含2%乳糖的MRS培养基中诱导培养过夜，同时以含pMJ67的重组乳酸杆菌为对照。取上述菌液12 000 r/min离心10 min，菌液上清通过超滤柱浓缩后加入10 m L PBS悬浮并超声破碎，离心后的上清及沉淀以及未破碎的重组乳酸杆菌菌液上清一起，进行SDS-PAGE检测，以小鼠抗His标签单克隆抗体(MAb)为一抗(1∶2 000)，山羊抗小鼠HRP-IgG为二抗(1∶5 000)，western blot分析。

1.8 重组蛋白抑菌活性的初步检测 用乳糖分别诱导空载体和pMJ67-SP-PBD1的重组菌，超声破碎后离心收集上清液。采用琼脂扩散试验进行重组蛋白抑菌活性的检测：取100μL葡萄球菌液均匀涂布于普通营养琼脂平板上，待菌液吸收完全，打孔器均匀打孔。每孔加入100μL重组PBD1蛋白上清液，37℃培养24 h，观察重组PBD1蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌现象。

2 结果

2.1 重组质粒pUCK-SP-PBD1的PCR及酶切鉴定结果 对构建的pUCK-SP-PBD1进行PCR扩增，获得1条约170 bp的目的片段。重组质粒经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切后出现了2条带，与预期结果相符(图略)。表明构建了重组质粒pUCK-SP-PBD1。

2.2 重组质粒pMJ67-SP-PBD1的构建及鉴定对pUCK-SP-PBD1进行双酶切获得SP-PBD1再将其克隆至载体pMJ67中构建重组质粒pMJ67-SPPBD1。对重组质粒pM J67-SP-PBD1进行PCR扩增鉴定，结果显示获得1条约170 bp的目的片段。重组质粒经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切后出现了2条带，与预期结果相符(图1)。对所获的基因序列测序分析，结果显示分别与GenBank中登录的PBD1基因序列(NM 213838)和短小乳酸杆菌(L.brevis)S-层蛋白信号肽基因序列(Z14250)同源性为100%，表明正确构建重组质粒pMJ67-SP-PBD1。

图1 重组质粒pMJ67-SP-PBD1的酶切鉴定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pMJ67-SP-PBD1 by enzyme digestion

2.3 重组乳酸杆菌的PCR鉴定及序列测定 提取经红霉素筛选为阳性的乳酸杆菌DNA，并使用引物P1/P2进行PCR扩增，结果显示获得1条约170 bp的目的片段，与预期相符(图2)。测序结果进一步表明猪PBD1基因整合至干酪乳酸杆菌中。

2.4 RT-PCR检测猪PBD1的转录水平 使用AlphaImageHP凝胶成像分析系统，对RT-PCR扩增的PBD1基因对应的各个条带的吸光度值进行分析，结果显示，在诱导12 h、14 h、16 h、18 h、20 h时，PBD1基因相对灰度值分别为 0.62、0.87、1.41、1.57、1.46，将不同时间点的灰度值依据时间的变化制作灰度值变化曲线，显示重组乳酸杆菌诱导18 h时，猪PBD1转录水平相对较高(图3)。

图2 重组乳酸杆菌的PCR鉴定Fig.2 Idendification of recombinant L.casei by PCR

图3 PBD1基因灰度值变化曲线Fig.3 The change of grey values curves for PBD1 gene

2.5 Western blot检测猪PBD1蛋白的表达 Western blot结果显示，含重组质粒pMJ67-SP-PBD1的重组菌，经乳糖诱导后重组菌的上清、重组菌破碎后上清、破碎后沉淀中均有一条约5.8 ku的蛋白，而对照pMJ67的重组菌未见任何条带(图4)。表明重组干酪乳酸杆菌表达了猪PBD1蛋白。采用Alpha Image Hp凝胶成像系统对胞内目的蛋白(PBD1-6xHis)的特异性条带进行灰度值分析，显示胞内表达的PBD1重组蛋白主要以可溶性形式表达。

2.6 重组PBD1蛋白的抑菌活性检测结果 采用琼脂打孔扩散法检测重组PBD1对葡萄球菌的抑制作用，结果显示，与仅含空载体的重组菌相比，含pM J67-SP-PBD1的重组菌表达的PBD1对葡萄球菌有明显地抑制作用(图5A、5B)。

3 讨论

图4 重组PBD1蛋白表达的western blot鉴定Fig.4 Western blotanalysisof recombinantPBD1 protein in Lb.casei

图5 重组PBD1蛋白的抑菌活性检测Fig.5 Antibacterial activity of recombinant PBD1 protein

PBD1基因编码区全长195 bp，共编码64个氨基酸，其中前21个氨基酸残基为信号肽，后42个氨基酸残基编码猪PBD1成熟蛋白。研究表明PBD1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎放线杆菌具有体外抑菌作用[12]，而且对宿主天然和获得性抗感染免疫具有重要调节作用，并通过对感染局部环境的改善而提高宿主抗感染能力[13]。考虑到在原核表达系统大肠杆菌内表达含信号肽的真核基因，会导致表达的重组蛋白易形成包涵体，且不利于重组蛋白复性，而影响其生物学活性[14-15]。因此，本实验仅选取编码PBD1成熟肽的129 bp核酸序列，并在其前面加上干酪乳酸杆菌自身SP，这样表达的PBD1成熟肽便可以在干酪乳酸杆菌SP作用下直接分泌到胞外。本实验构建的干酪乳酸杆菌表达系统不仅实现PBD1蛋白的可溶性表达，而且更有利于蛋白的纯化。

本实验对重组猪PBD1在干酪乳酸杆菌中的表达情况分别在mRNA转录水平和蛋白水平进行了分析。将转化pMJ67-SP-PBD1的干酪乳酸杆菌在含乳糖的MRS培养基中进行诱导，在诱导18 h时PBD1mRNA转录水平达到峰值。经western blot分析显示，重组乳酸杆菌诱导18 h后的菌体破碎后上清及沉淀中均表达了约5.8 ku的目的蛋白，与预期猪PBD1蛋白大小相符。抑菌试验显示，表达的重组蛋白对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌活性。本研究将进一步对猪重组PBD1的抑菌、抗病毒活性进行验证，为研发具有广谱抗菌作用的微生态制剂奠定基础。