狐肺炎大肠杆菌毒力基因和耐药基因检测及药物敏感性分析

朱利霞，王洪彬，赵希艳，王双月，史秋梅，高光平

(河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛 066604)

中国毛皮动物规模性饲养始于20世纪50年代，到90年代中期，毛皮动物养殖业迅速发展，使中国成为世界上毛皮动物养殖数量最多的国家之一。随着毛皮动物养殖数量的增加和养殖密度的增大，细菌性疾病的种类也日趋增多，尤其是狐肺炎大肠杆菌病对狐狸养殖业造成了极大的威胁。抗生素一直是治疗动物细菌性疾病的首选药物。随着抗生素的不合理使用，导致狐肺炎大肠杆菌耐药谱变宽、多重耐药菌株增加，耐药现象更加普遍[1]。自2010年以来，大肠杆菌的耐药性在全世界呈现明显上升趋势，应引起学者和养殖从业人员的关注。因此，了解大肠杆菌耐药基因分布情况，对其耐药机理进行深层次研究，对于控制大肠杆菌耐药菌株的蔓延具有极为重要的意义。

致病性大肠杆菌作为狐肺炎大肠杆菌病的病原菌，菌株的耐药性与其自身携带的耐药基因有关，其致病性与其自身携带的毒力基因有关，因此对这两类基因进行筛查，可以很好的评估大肠杆菌的致病能力，对筛选出能够较好抑制病原菌的敏感药物，具有重要的指导意义。本实验以狐肺炎大肠杆菌临床分离菌株为试验菌株，进行毒力基因和耐药基因检测以及药敏试验、动物致病性试验，为阐明河北地区狐肺炎大肠杆菌发病机理奠定基础，为采取合理的防治策略提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料样品、菌株及实验动物 病料样品来源于2016年5月～2017年5月采集自沧州市(49份)、唐山市(37份)、秦皇岛市(53份)、邯郸市(29份）、石家庄市(35份)、承德市(28份)、邢台市(34份)、衡水市(41份)共306份病死狐狸的肝、心、脾、肺、肾实质性组织样品；大肠杆菌ATCC 25922菌株为质控菌株，购自中国兽医药品监察所；健康、清洁级昆明系小白鼠，20±2 g，雌雄各占一半，购自北京维通利华试验动物有限公司。

1.2 主要试剂 营养琼脂(NA)、营养肉汤(NB)、伊红美蓝琼脂(EMB)、麦康凯琼脂(MAC)、常规药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；2×PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker，购自天根生化科技(北京)有限公司。苏木、栀子、乌梅、诃子、艾叶、女贞子、夏枯草、五味子、黄连、蒲公英、金银花、厚朴、知母、苦参、芦根、白头翁、紫花地丁、大黄、秦皮、黄芩、黄柏、青皮、香附、茵陈蒿、大青叶、紫苏叶、荆芥、防风、连翘、射干、五倍子、板蓝根、龙胆草，购自秦皇岛民乐药店。

1.3 引物的设计与合成 根据文献报道合成大肠杆菌耐药基因(blaTEM 1、blaPSE1、blaOXA1、blaTEM、blaSHV-1、blaCTX-M、aadA1、strA-strB、tetA、tetB、tetC、tetD、ermB、ermC、ermF、sul1、sul2、sul3)[2-3]引物及毒力基因(ler、eaeA、irp2、fyuA)引物[4]。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 病原菌的分离及鉴定

1.4.1 分离纯化和初步鉴定将采集的306份患病死亡狐狸的肝脏、脾脏等实质性脏器组织样品用无菌棉签涂布于MAC培养基上，于37℃培养12 h～16 h，挑取单个典型菌落涂片，革兰染色镜检，观察细菌形态及染色特性，进行初步鉴定；再将镜检后的疑似大肠杆菌的菌落划线接种于新鲜制备的EMB培养基上，培养12 h～16 h后，观察菌落形态特征；挑取带有金属光泽的单个菌落接种于BHI肉汤中，于37℃培养12 h～16 h，保存备用。

1.4.2 生化鉴定和PCR鉴定将带有金属光泽的分离菌经MAC培养基、EMB的初步培养，利用ID32E自动化生化鉴定系统进行生化鉴定。采用高温裂解法制备细菌的基因组DNA。采用文献[5]中报道的大肠杆菌特异性引物，扩增大小为720 bp目的基因片段。引物序列为：F：5-CGATTCTGGAA ATGGCAAAAG-3'/R：5'-CGTGATCAGCGGTGACTA TGAC-3'；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为50μL：2×PCR Master Mix 25μL，10μm/L的上下游引物各 2μL，模板DNA 1μL，ddH2O 20μL。反应条件为：94℃5min～10 min；94℃ 1 min、54℃ 45 s、72℃ 90 s，32个循环；72℃10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测并回收，由北京赛百胜基因技术有限公司测序。

1.5 毒力基因检测 采用PCR检测分离菌的毒力基因Ler、eaeA、irp2、fyuA。PCR反应体系：2×TaqMaster Mix 12.5μL，上、下游引物各 1μL，DNA模板1μL，ddH2O补至25μL。反应程序：94℃5 min；94℃ 50 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min，30个循环；72℃10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测并回收后克隆至pMD18-T载体。经PCR检测的阳性菌株，提取质粒后测序。

1.6 耐药基因检测 采用大肠杆菌β-内酰胺类(blaCTX-M、blaTEM、blaSHV-1)、 磺 胺 类 (sμl1、sμl2、sμl3)、四环素类(tetA、tetB、tetC、tetD)、耐链霉素类(strA-strB、aadA1)、大环内酯类(ermB、ermC、ermF)、耐氨苄西林类(blaTEM 1、blaPSE1、blaOXA1)6类共18种耐药基因引物，利用PCR技术对分离菌进行检测。PCR反应体系：2×TaqMaster Mix 10μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O补至20μL。反应程序：95℃ 5 min；94℃ 50 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min，30个循环；72℃10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

同时参照CLSI推荐的K-B法测定分离菌株对氨苄西林、替米考星、头孢拉定、头孢曲松、阿莫西林、土霉素、多西环素、链霉素、磺胺间甲氧嘧啶、复方新诺明、环丙沙星、恩诺沙星、林可霉素、卡那霉素、阿米卡星、大观霉素16种抗生素药物的耐药性。结果依据CLSI标准判定，每个菌株做3次重复，取平均值进行判定。分析耐药基因与其药敏性间的相关性。

1.7 中药药敏试验

1.7.1 细菌活化及菌落计数将分离菌划线接种于NA培养基上，接种后置于37℃隔水式恒温培养箱中培养12 h～16 h；待长出单个菌落后，接种于EMB培养基上培养，长出单个菌落后，接种于NB培养液中，置于37℃，180 r/min摇床培养细菌至对数期；采用菌液倍比稀释法进行计数；用PBS稀释配成菌液终浓度为1×107cfu/m L，备用。

1.7.2 中药体外抑菌圈的测定根据文献[6]中报道的水煎煮法制备中药药液至终浓度为1 g/m L，进行中药体外抑菌试验。无菌吸取分离菌菌液100μL滴在NA培养基上并涂布均匀；在每个NA培养基均匀打5个孔，并用0.5%的琼脂封底，做好标记；在孔中加满药液，中间加入无菌NB做空白对照，每种药物重复3次，置于37℃隔水式恒温培养箱中培养12 h～16 h后，用游标卡尺测量每种药物的抑菌圈大小，取3次测量抑菌圈直径的平均值作为该中药的抑菌圈直径。判定标准：抑菌圈直径≥20mm为极敏，20 mm＞抑菌圈直径≥15 mm为高敏，15 mm＞抑菌圈直径≥10mm为中敏，抑菌圈直径＜10mm为低敏或耐药[7]。

1.7.3 中药最小抑菌浓度(MIC)的测定采用试管二倍稀释法[8]进行中药对分离菌的MIC值的测定。

1.7.4 中药最小杀菌浓度(MBC)的测定将上述各个试管中的分离菌菌液吸取50μL均匀涂布于NA平板上，于37℃隔水式恒温培养箱中培养12 h～16 h后，观察结果。以平板上无细菌生长时的最低药物浓度判定为其的MBC。

1.8 分离菌的动物致病性试验 首先将分离菌分别接种于LB培养液中，置于37℃摇床中培养12 h～16 h。将小白鼠按照分离菌数分成相对应的实验组，每组5只；同时设1组空白对照组。实验组每只小白鼠腹腔注射0.2m L分离菌菌液，对照组注射等体积无菌LB培养基。接种后观察小白鼠的发病和致死情况，并及时解剖病死的小白鼠，无菌取肝脏和肺脏等实质性脏器进行病原分离鉴定。

2 结果

2.1 大肠杆菌的初步鉴定 将采集的306份病死狐狸的肝脏、脾脏等实质性脏器组织样品经MAC培养基初步筛选，经EMB培养基再次筛选，可见光滑湿润、边缘整齐的带有金属光泽的黑色菌落，经初步分离鉴定出81株疑似大肠杆菌菌株。

2.2 菌株生化鉴定和PCR鉴定 根据法国梅里埃细菌全自动微生物鉴定系统对81株疑似大肠杆菌的分离菌株进行生化鉴定，结果显示81株菌均为大肠杆菌；采用PCR技术利用大肠杆菌特异性引物进行检测，结果显示，81株大肠杆菌均得到了特异性扩增(图1)。电泳回收PCR产物后测序比对后，最终确定分离到大肠杆菌81株(菌株编号分别为E.coliQHD-1～E.coliQHD-81)，分离率为26.5%。

图1 部分大肠杆菌临床分离菌株的PCR检测Fig.1 PCR results of partial E.coli clinical isolates

2.3 毒力基因检测结果 采用PCR技术对81株大肠杆菌毒力基因进行检测，回收阳性PCR产物测序后结果显示，irp2、fyuA、Ler、eaeA毒力基因均在狐肺炎大肠杆菌分离菌株中检测到，且与预期相应条带的大小相符，测序结果显示为阳性；共有4株大肠杆菌分离菌株同时携带这4种毒力基因，有37株同时携带HPI毒力岛基因irp2、fyuA，6株分离菌株同时检出LEE毒力基因Ler、eaeA。毒力基因Ler、eaeA、irp2、fyuA检出率分别为9.9%、23.5%、50.6%、56.8%。表明，HPI毒力基因irp2、fyuA在大肠杆菌临床分离株的携带率较高。

2.4 耐药基因检测结果 选择18种耐药基因，采用PCR技术，对81株大肠杆菌分离菌株进行耐药基因的检测，结果见表1。表明河北地区狐肺炎大肠杆菌耐药基因的携带情况较为严重。

同时采用K-B法对81株大肠杆菌进行16种抗生素的药物敏感性检测。结果显示，81株大肠杆菌均对磺胺间甲氧嘧啶、林可霉素、头孢拉定、替米考星、复方新诺明耐药，对头孢曲松的耐药检出率小于10%，对环丙沙星、阿米卡星、恩诺沙星、卡那霉素、大观霉素耐药检出率在10%以上且小于20%，多西环素、氨苄西林、阿莫西林、链霉素耐药检出率在20%以上且小于30%；对土霉素的耐药检出率在30%以上且小于40%。在16种抗菌药物中，耐5种抗生素的有46株，耐6种有10株，耐7、9种抗生素各有6株，耐8种抗生素的有3株，耐11、12种抗菌药的各有4株，耐13种抗菌药物的有2株(表1)。表明，狐肺炎致病性大肠杆菌是多重耐药菌，且多重耐药情况较严重。

表1 分离菌株耐药基因与耐药性的符合率Table 1 Coincidence rates of resistance gene and resistance

分析耐药基因与耐药性的相关性，结果见表1，表明分离菌株的耐药性和其自身携带的耐药基因具有一定的相关性。

2.5 中药体外抑菌试验结果 采用琼脂平板打孔法对大肠杆菌进行中药体外抑菌作用检测。结果显示，81株大肠杆菌对诃子、乌梅、五味子极敏，抑菌圈直径在20 mm～36 mm之间；对五倍子高敏；对苏木、女贞子中度敏感或低度敏感；E.coliQHD-1、E.coliQHD-4、E.coliQHD-35、E.coliQHD-12、E.coliQHD-16、E.coliQHD-65、E.coliQHD-79菌株对夏枯草中敏，而其它菌株对其表现耐药；栀子、艾叶、知母、紫花地丁、大黄、黄柏、黄芩、秦皮、香附、茵陈蒿、大青叶、紫苏叶、荆芥、防风、连翘、射干、板蓝根、龙胆草、白头翁、芦根、蒲公英、青皮、金银花、黄连、厚朴、苦参对81株大肠杆菌无抑制作用。表明，部分中药对大肠杆菌具有一定程度的体外抑菌作用，但其抑菌效果不尽相同。

2.6 中药对大肠杆菌MIC和MBC测定结果 采用试管二倍稀释法对大肠杆菌进行MIC和MBC的检测。结果显示，苏木、女贞子对81株菌的MIC和MBC均为62.50 mg/m L～250.00 mg/m L；诃子、乌梅、五味子对81株菌的MIC和MBC均为7.81mg/m L～62.50mg/m L；五倍子对81株菌的MIC和MBC均为15.63 mg/m L～125.00 mg/m L；夏枯草对E.coliQHD-1、E.coliQHD-4、E.coliQHD-35、E.coliQHD-12、E.coliQHD-16、E.coliQHD-65、E.coliQHD-79菌株的MIC和MBC均为250mg/m L～500 mg/m L，对其它菌株无抑菌作用。表明，同一种中药对不同的大肠杆菌分离菌株抑菌活性不同，不同中药对同一分离菌株的抑菌活性也不同，MIC和MBC的检测结果对指导临床用药剂量有一定的参考价值。

2.7 动物致病性试验结果 采用腹腔注射的方式进行动物致病性试验。结果显示，小白鼠在接种大肠杆菌后，24 h左右开始出现不同程度的症状，主要表现为呼吸急促、双眼半闭、腹围增大、精神沉郁、运动迟缓等，72 h之内出现不同程度的死亡；同时携带irp2、fyuA毒力基因菌株比同时携带ler、eaeA毒力基因的菌株感染小白鼠导致其发病和死亡早，且携带多种毒力基因菌株感染的小白鼠要比携带单个或两个毒力基因、甚至不携带毒力基因的小白鼠发病和死亡早；剖检病死的小白鼠发现，内脏充血或者出血明显，脾肿大，腹腔内有黄色纤维素性渗出物，肝脏肿胀、出血，心外膜出血、小肠水肿、肠腔积液等。从死亡的小白鼠的肝脏、心血、腹水、肠内容物中，均分离到了所接种的病原菌，而对照组小白鼠生长状况良好，无异常表现。表明，81株大肠杆菌具有一定的致病性，且携带多种毒力基因的菌株致病性较强。

3 讨论

大肠杆菌在自然界中广泛存在，是一种重要的人-兽共患的条件性致病菌。本研究从河北省不同地区采集的306份狐狸实质性脏器样品中分离到81株大肠杆菌，分离率为26.5%，该结果表明大肠杆菌是狐狸感染发病的主要病原菌之一。赖婧等分离猪源大肠杆菌286株、牛源大肠杆菌143株、鸡源大肠杆菌371株，共获得大肠杆菌800株，分离率极高[9]；展天松等对南京、镇江、扬州、盐城以及安徽天长等地区送检病死的羊、鸡、鹅等动物进行细菌的分离、鉴定，获得78株大肠杆菌，其中肠致病性大肠杆菌分离率为21.8%[10]，以上均表明大肠杆菌是引起动物感染性疾病的病原菌之一。

毒力岛(Pathogenicity island)指细菌染色体中编码毒力相关基因的特殊区域，是某些细菌在进化过程中适应环境变化而获得的毒力基因。其中强毒力岛(HPI)，即耶尔森菌毒力岛，主要结构基因是fyuA、irp1、irp2；基因irp2为标志基因，与耶尔森氏菌的铁摄取能力有关，基因fyuA与耶尔森氏菌的鼠疫菌素敏感性有关，因此大肠杆菌高致病性HPI作为重要致病因子，在毛皮动物大肠杆菌的致病中发挥极为重要的作用[11]。由于HPI有利于细菌从环境中摄取铁，而且与大肠杆菌的致病性密切相关，高频率的HPI出现表明，这些狐狸源大肠杆菌可能具有很高的致病性，因此应引起科研人员的关注；肠细胞脱落位点毒力岛(LEE)主要由eaeA、Ler、Sep A-I、espAB基因组成，该毒力岛常见于肠致病性、肠出血性大肠杆菌中。其中基因eaeA编码外膜蛋白紧密黏附素，其功能是介导细菌粘附肠上皮细胞。本实验利用PCR技术对E.coliQHD-1～E.coliQHD-81进行Ler、eaeA、irp2、fyuA毒力基因检测。结果显示，在81株大肠杆菌中同时携带2种及2种以上毒力基因的菌株所占比率较大，同时携带2种HPI毒力基因的菌株检出率为45.8%，同时携带2种LEE毒力基因的菌株检出率为7.4%；毒力基因Ler、eaeA、irp2、fyuA检出率分别为 9.9%、23.5%、50.6%、56.8%，表明河北地区狐肺炎大肠杆菌中主要流行的毒力因子为fyuA和irp2；动物致病性试验结果显示，81株大肠杆菌均能够导致小白鼠不同程度的发病、死亡，其中携带2种或2种以上毒力因子的菌株对小白鼠的致病性强于只携带1种毒力基因的菌株，同时携带2种HPI毒力基因的菌株比同时携带2种LEE毒力基因的菌株对小白鼠的致病力强。总之，大肠杆菌毒力岛与与其毒力关系密切，对毒力岛的研究为了解细菌的致病性和毒力因子提供了有效的途径，为阐明病原菌致病机理、认识和预测新发传染病等方面有着重要的意义。西药药敏试验结果显示，在16种抗菌药物中，耐5种抗生素的有46株，耐6种有10株，耐7、9种抗生素各有6株，耐8种抗生素的有3株，耐11、12种抗菌药的各有4株，耐13种抗菌药物的有2株，表明该地区的大肠杆菌耐药严重；建议在临床用药物之前一定要根据药敏试验结果选择敏感性较强的药物用于细菌病的防控。

随着抗生素的滥用造成细菌耐药性增加以及多重耐药菌株层出不穷，给细菌性疾病的防控造成了极大的困难。中药成本低廉、低毒高效、病原菌不易产生耐药性，发挥了抗生素无法替代的作用，中药制剂在人、动物细菌性疾病防治中起到了重要的作用。本实验中诃子、乌梅、五味子对81株大肠杆菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径大于20 mm；此外，病原菌对这3种药物的敏感度最高，MIC和MBC均在7.81 mg/m L～62.50 mg/m L之间。尤其是五味子对81株大肠杆菌的抑菌圈直径相对较大，MIC和MBC均较小，表明病原菌对五味子具有较高的敏感性。每种中药对不同的大肠杆菌临床分离菌株MIC和MBC不同。中药的MIC和MBC的测定结果对指导临床用药剂量有一定的参考价值，但该结果只能说明选用中药与细菌直接接触所产生的影响，而对被细菌感染患病的动物的治疗效果，须进行动物体内试验才能证实；此外中药对动物机体的营养和调节作用也是不可忽视的。很多中药具有抑制病原菌生长、杀灭病原菌的作用，如五倍子、五味子、诃子和乌梅等，其抑菌主要成分不同，如多糖、生物碱、黄酮类以及有机酸类等，因此应用中药防控细菌病具有良好的发展前景。向双云等证实了五味子对大肠杆菌的抑菌效果较好[12]，这与本实验结果基本一致；李树明等研究50味中药对猪大肠杆菌K88和禽大肠杆菌及溶血性大肠杆菌的抗菌活性，结果显示只有金银花和山楂同时对3种病原菌起抑制作用，而抑制程度有差别[13]，这与本实验结果不一致，原因可能在于菌株来源地、基因型和血清型以及中药提取方式不同等。此外，中药成分复杂，其抗菌机制和有效成分、作用机制尚未完全明了，需要科研工作者进行更深层次的的研究。本研究调查了河北地区狐肺炎大肠杆菌流行情况，对其毒力基因和耐药基因进行检测及药物敏感性分析，为狐肺炎大肠杆菌病的防控提供参考，为深入研究该菌致病机制奠定基础，也为合理用药提供依据。