黄连解毒汤对SD大鼠粪便脂肪酸代谢的影响*

汪席敏， 李慧，王安宇， 杨光勇， 王文佳， 何光志△， 田维毅， 蔡琨， 王平， 梁建东

1贵阳中医学院基础医学院(贵州贵阳 550002)；2遵义市中医院内分泌科(贵州遵义 563000)

黄连解毒汤(Huanglianjiedu decoction，HLJD)最早记载于《外台秘要》，是清热方药的经典代表方，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，其主治是三焦火毒炽盛症。然而，HLJD由黄连、黄柏、栀子和黄芩四味均为苦寒之品所组成。据资料报道许多苦寒中药对胃肠道具有刺激性，对胃肠道黏膜功能和激素水平会产生不同程度的影响[1]，那么苦寒中药在临床应用上会不会引起宿主代谢组的改变？本次研究从2017年9月着手探讨研究方案并于2018年2月完成实验部分，拟采用高中低剂量HLJD干预实验动物SD大鼠后观察其粪便脂肪酸代谢的影响进行探讨，考证“苦寒伤胃”之说，为评价HLJD的临床合理应用等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要设备与试剂 健康SPF级SD大鼠120只，雄雌各半，体重105～116 g，购自重庆腾鑫有限公司[动物合格证SCXK(军)2012-0011]提供；电子秤；震荡仪；台式离心机(TGL-16G上海安亭科学仪器公司)；气质联色谱仪(型号：GCMS-QP2010C)，日本岛津公司；色谱柱：RTX-WAX柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；黄连、黄芩、黄柏和栀子，购自北京同仁堂药店(贵阳分店)。标准品L-乳酸(批号：A19J8L40142)，标准品异丁酸(批号Z18D6H7816)，标准品戊酸(批号：Z13A8H33669)，标准品异戊酸(批号：F22N7E25082)和标准品萘(批号：Q21J8C38350)均购自上海源叶生物科技有限公司；色谱甲醇(批号：20101127)，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HLJD水煎液制备 HLJD按照相关的文献[2]取成人用药剂量，黄连9 g、黄芩6 g、黄柏6 g和栀子9 g，加入200 mL纯水浸泡30 min，加热至沸腾后保持1 h，以4层无菌纱布过滤出药液，药渣再次加入150 mL纯水，加热沸腾后继续保持1 h，以4层无菌纱布过滤药液，然后合并2次煎液，浓缩调整浓度为0.086 g/mL。

1.2.2 动物分组 将120只SD大鼠随机分为5组，每组24只，将SD大鼠分为HLJD高剂量组、HLJD中剂量组、HLJD低剂量组、空白组和抗生素组。其中HLJD中剂量组为成人用量30 g/70 kg换算而来，体重计算为4.29 g/kg[3]，HLJD高剂量组为中剂量组的2倍用量，HLJD低剂量组是HLJD中剂量组的1/2用量。抗生素组参照张文娣[4]使用剂量进行，其链霉素、氨苄西林、克林霉素按照2∶1∶1.8比例调配。空白组则是灌胃相同体积的蒸馏水。各组灌胃浓度与体积见表1。

表1 各组大鼠灌胃浓度

1.2.3 临床腹泻观察 各组分别用相应药物进行灌胃后，每天临床观察腹泻情况。

1.2.4 实验动物粪便中脂肪酸含量的检测

1.2.4.1 样本采集 分别于实验动物灌14 d后收集的粪便混合，置于1.5 mL无菌EP管内，再存放于-80℃冰箱中保存。称取粪便样品0.1 g于1.5 mL离心管中；加入400 mL乙醇浸泡12 h，置于4℃离心机内以12 000 r/min离心15 min，取上清200 μL于0.22 μm有机滤膜滤过即得粪便样本。以GC-MS法完成各大鼠粪便样本中乳酸、异丁酸、异戊酸、戊酸和萘的浓度测定。

1.2.4.2 气相色谱-质谱(GC-MS)法检测粪便脂肪酸含量 参照相关文献方法进行GC-MS[5]。GC：取上述经前处理的样品1 μL，测定条件为气相色谱：载气为氦气，流速为1.06 mL/min，用30 m×0.25 mm的RTX-WAX为色谱柱，采用程序升温的方法，起始温度40℃，持续1 min，以18℃/min升温至180℃，再以20℃/min升至240℃，保持5 min，进样口温度230℃，传输线温度为240℃，运行时间为12.5 min。MS：扫描范围20～200 m/z，扫描模式：SIM。监测离子：乳酸(L-Lactic acid)45 m/z，异丁酸(isobutyric acid)73 m/z，戊酸(pentanoic acid)60 m/z，异戊酸(isopentanoic acid)60 m/z，萘(naphthalene)128 m/z，离子源温度200℃，EI源轰击能70 eV。各样本检测均设定2个平行样本，各个平行样本均检测2次。试验采用出峰保留值比较法完成大鼠粪便代谢物中乳酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和萘的定性分析。用出峰面积结合外标一点法完成大鼠粪便中乳酸、异丁酸、异戊酸、戊酸与萘的定量分析。

2 结果

2.1 临床腹泻观察 HLJD中、低剂量组和空白组SD大鼠精神和食欲及大小便形态正常。抗生素组和HLJD高剂量组大鼠5 d后逐渐出现腹泻、被毛粗乱无光泽、粪便不成形，随着时间延长逐渐行动缓慢、饮食逐渐下降、粪便稀，而且腹泻加重个体出现精神极差和形体消瘦等症状。

2.2 各组动物粪便中乳酸、异丁酸、异戊酸、戊酸和萘含量的影响 与空白组比较，HLJD高剂量组和抗生素组粪便中乳酸、异丁酸、异戊酸、戊酸、萘含量呈显著性降低(P<0.05)，HLJD中剂量组样本异戊酸、戊酸、萘呈显著性降低(P<0.05)；与HLJD低剂量组比较，HLJD高剂量组和抗生素组实验动物中乳酸、异丁酸、异戊酸、戊酸和萘含量呈显著性降低(P<0.05)，HLJD中剂量组异戊酸和戊酸含量差异有统计学意义(P<0.05)。见表2及图1。

组别乳酸异丁酸异戊酸戊酸萘抗生素组0.030±0.003∗△0.124±0.016∗△0.000 11±0.000 02∗△ 0.000 21±0.000 03∗△ 0.021±0.003∗△HLJD高剂量组0.326±0.005∗△0.206±0.024∗△0.000 22±0.000 03∗△0.000 31±0.000 02∗△0.035±0.003∗△HLJD中剂量组0.046±0.0040.496±0.0600.000 37±0.000 04∗△0.000 36±0.000 04△0.036±0.005∗HLJD低剂量组0.458±0.0080.554±0.0910.001 19±0.000 300.000 61±0.000 040.043±0.005空白组0.994±0.0111.574±0.106△0.003 28±0.000 390.000 95±0.000 050.151±0.020

*与空白组比较P<0.05；△与HLJD低剂量组比较P<0.05

A：对照品；B：空白组；C：HLJD低剂量组；D：HLJD中剂量组；E：HLJD高剂量组；F：抗生素组；1：乳酸；2：异丁酸；3：异戊酸；4：戊酸；5：萘

3 讨论

本研究采用高中低剂量的HLJD对SD大鼠进行灌胃，在14 d后采集粪便样本，运用GC-MS对样本中粪便中脂肪酸乳酸、异丁酸、异戊酸、戊酸、萘的含量进行检测，结果发现高剂量HLJD与抗生素组实验动物粪便中乳酸、异丁酸、异戊酸、戊酸、萘含量发生明显降低(P<0.05)，结果提示高剂量HLJD和抗生素都会引起宿主脂肪酸代谢发生明显改变。从实验结果来推测，高剂量的HLJD可能有抗生素样作用，因此引起高剂量组大鼠有与抗生素组大鼠相似的症状。而中剂量HLJD组大鼠在实验结果中并未出现与抗生素组大鼠腹泻等类似的症状，与实验数据分析中存在自相矛盾的状况，这是本研究中存在的一个尚不明确的盲点，猜想或许是在HLJD高剂量组和中剂量组的用药剂量中存在某个阈值，超出这个值则大鼠呈现与抗生素相类似的症状。这个阈值将成为进一步研究探讨的方向，值得深度剖析解答。

现代医学研究发现HLJD在一定程度上影响肠道菌群分布，从而对于小鼠脂肪酸代谢产生影响[6-7]。代谢组学是通过对于内源性代谢物图谱的信息分析，来评价药物安全性的可行方法，可以精准发现药物的使用结果及其规律[8-9]。粪便代谢组被认为是肠道菌群代谢与宿主代谢组成的共同代谢[10]。据报道乳酸浓度的变化一定程度上反映出肠道内乳酸杆菌群的数量变化[11]。而异丁酸、萘的浓度主要与理研菌科、瘤胃球菌科呈正相关，戊酸、异戊酸的浓度则主要与毛螺旋菌科、消化球菌科呈正相关[12]。

HLJD由黄连、黄柏、黄芩和栀子四味苦寒中药组成。“苦寒伤胃”之说也一直为历代医药学家所关注。罗海华等[13]发现，采用高剂量苦寒方药HLJD会引起小鼠肠道菌群失调，有类似滥用抗生素的破坏作用。在本研究中，抗生素能改变实验动物粪便脂肪酸代谢，抗生素性味苦寒，与中医苦寒中药有相似之处。抗生素的滥用能导致胃肠道菌群失调，一些抗生素常常用于肠道菌群失调的动物模型的制备[14-15]。本研究重点在于把成分较为单一且药物作用机制相对清楚的抗生素作为参比，来推敲药物有效成分较为复杂且作用机制尚不明确的方药HLJD的合理使用，为探讨现有众多方药的研究提供一定的依据。

综上所述，高剂量HLJD导致宿主胃肠道微生态失调，体内相应的代谢过程和代谢产物也随之发生改变，这可能是高剂量HLJD导致宿主脂肪酸代谢明显降低的可能原因。本研究结果为评价HLJD的临床合理应用等提供科学依据，并为进一步探索HLJD胃肠道菌群结构-代谢组的药理毒理评估模式积累研究基础。