质谱技术鉴别肺癌痰液的实验研究*

郑巧灵， 张建勇， 张文雄， 梁永刚， 喻东亮， 魏益平， 徐建军

南昌大学第二附属医院胸心外科(江西南昌 330008)

肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一，其病死率均居恶性肿瘤首位[1-2]。有研究表明I～II期肺癌患者的5年生存率明显高于Ⅲ～Ⅳ期，但由于大约65%肺癌患者确诊是已经为晚期，这部分患者的5年生存率仅为5%左右，从而导致肺癌的总体5年生存率约为10%～18%[3]。因此，提高肺癌的早期诊断率是改善肺癌预后的关键。目前临床上，肺癌早期诊断仍以传统的X线、细胞CT、痰脱落细胞及支气管镜等方法为主，近年来，肺癌的早期诊断在影像学、支气管镜检查和分子标志物检测等方面取得了一定的进展，但有研究表明，目前主流的肺癌早期筛查方法应用于肺癌的筛查并不能降低肺癌的病死率[4]。痰液中含有与肺部疾病相关的分子信息，在大部分肺部疾病中，如肺结核、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺炎及肺癌等，痰液检测是诊断或鉴别这些疾病非常有效的的方法[5]。但目前由于敏感度低、可重复性差等缺点，痰液检测在临床中肺癌诊断和筛查方面的运用受到了极大的限制[6]。因此，开发一种敏感度高、特异度强、可重复的肺癌筛查新方法显得尤为重要。质谱分析(MS)技术是一种敏感度高、特异度好、响应速度快的现代分析测试技术[7]。中性解吸电喷雾电离质谱技术(ND-EESI-MS)方法是适用于黏稠的复杂基质，已运用于蜂蜜、牙膏及化妆品等黏稠物的分析[8]。本研究运用ND-EESI-MS耦合最小偏二乘法(PLS)鉴别肺癌痰液及非肺癌痰液。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究经南昌大学第二附属医院伦理委员会认证，连续收集2016年1—6月同一治疗组符合纳入标准的患者，肺部疾病患者留痰液标本前未使用任何药物；每例患者留取痰样前空腹8 h以上；取样时先用生理盐水漱口2次；留取患者晨起第一口深部痰，所留取痰样置于-80℃保存。入选患者根据手术后病理结果分为肺癌组和对照组，其中肺癌组67例，年龄41～78岁，其中鳞癌27例、腺癌35例、5例腺鳞癌。对照组(良性肺疾病及健康者痰液)43例，年龄24～75岁，其中肺炎5例、支气管扩张的13例、9例慢性阻塞性肺疾病及健康人16例。

纳入标准：(1)肺癌组，以肺癌诊断入院，留取入院次日痰液，手术中病理确诊为肺癌。(2)对照组(良性肺疾病及健康者痰液)，手术病理为肺部良性疾病患者或排外恶性肿瘤患者及健康对照组，生理盐水漱口后留取晨起第一口深部痰。

1.2 材料 ND-EESI离子源(ZL201610079585.X)[9]；LTQ-XL增强型线性离子阱质谱仪，配有Xcalibur数据处理系统(美国Finnigan公司)；KQ3200型超声清洗仪(昆山超声仪器有限公司)。甲醇(色谱纯, 美国Fisher Scientific公司)；醋酸 (分析纯 上海试剂化学有限公司)；实验用水为2次去离子水。

1.3 ND-EESI-MS分析 痰液的ND-EESI-MS分析方法：痰液样品未经任何处理，解冻后直接置于样品管中进行分析。设置ND-EESI离子源为正离子模式，质量范围50～500 Da；离子传输管温度150℃；喷雾电压3.5 kv；透镜电压60.00 v；电喷雾氮气压力0.4～0.6 Mpa，解吸氮气压力3.2 Mpa，其他条件系统自动优化，具体参数细节示意图(图1)。

萃取液在电喷雾气体和高电压作用下雾化并发生电离产生“带电雾滴”。痰液样本在中性解吸装置中(图示左下部分)高压解吸气体的作用下，解吸出痰样中的中性有形成分，经进样喷头到达“电喷雾萃取区”与其中的“带电雾滴”混合，发生实时“液-液微萃取”和电离，从而使样本中解吸出来的中性分子形成带电微粒进入质谱仪中检测质荷比(m/z)得到质谱数据

图1 ND-EESI-MS示意图

1.4 ND-EESI-MS指纹谱图的PLS分析及相对丰度的统计学分析 将ND-EESI-MS所记录的痰液样品的质谱指纹谱图的相对丰度数据导出，并将数据整理为每行代表1个样本，每列代表1个质荷比(m/z)值的矩阵X。用Matlab Toolbox进行PLS分析结果，上述数据处理方法均在Matlab7.8中编程实现。离子的相对丰度统计学分析均在SPSS 21.0 中完成。

2 结果

2.1 痰液ND-EESI-MS质谱指纹图谱 采用ND-EESI-MS技术，在正离子模式下，通过实验能得到肺癌者痰液、良性肺疾病者痰液及健康者痰液样品的一级质谱指纹图谱，通过对比发现，良性肺疾病者痰液与健康者痰液样本一级质谱指纹图谱数据无明显差异，故将良性肺疾病者痰液与健康者痰液定义为对照组，与肺癌者痰液样本进对比分析，通过比较两组痰液样品的指纹图谱，可见两组样本指纹图谱在m/z99.99，m/z115.00，m/z171.83，m/z207.97，m/z250.81，m/z274.39， m/z278.87，m/z318.37，m/z346.30，m/z348.10，m/z374.37，m/z376.15，m/z390.42等处的质谱峰的信号强度有较明显的差异。见图2。

A：肺癌组痰液，质谱指纹离子以m/z115.00，m/z250.81，m/z274.39，m/z278.87，m/z318.37，m/z348.04，m/z376.15，m/z390.42为主；B：对照组痰液，质谱指纹主要离子为m/z99.99，m/z115.00，m/z171.83，m/z207.97，m/z274.23，m/z278.98，m/z318.26，m/z346.30，m/z348.10，m/z374.37，m/z390.34等。

图2肺癌痰液及对照组痰液一级质谱指纹图谱

2.2 痰液ND-EESI-MS质谱指纹PLS分析结果 将肺癌组与对照组(肺良性疾病组及健康组)痰液ND-EESI-MS质谱指纹图谱进行PLS分析，发现两组样本一级质谱指纹图谱数据能够明显区分(图3-A、B、C)，根据对区分的离子贡献结果，本研究发现其中主要的差异性物质是m/z238、m/z251、m/z274、m/z279、m/z348、m/z374、m/z379和 m/z391之间的相对丰度差异最为明显，见图3-D。

2.3 比较两组样本中差异性离子的相对丰度 对PLS分析发现的差异性离子相对丰度进行对比分析，发现m/z238、m/z279、m/z348及m/z379在肺癌患者痰液中的相对丰度明显高于对照组痰液(均P<0.05)，而m/z251及m/z391在肺癌患者痰液中的相对丰度明显低于对照组痰液(均P<0.05)。m/z274及m/z374的相对丰度在两组痰液样本中无明显差异(均P>0.05)。见表1、图4。

3 讨论

肺癌是我国发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，早期肺癌患者生存率明显优于中晚期患者，但目前2/3左右患者诊断时已为晚期，提高早期诊断率是目前急需解决的问题[1]。目前肺癌的诊断方法主要是传统的X线、胸部CT、血液检验、痰脱落细胞及支气管镜等方法，但这些方法或多或少存在一定缺陷，如影像学检查有辐射、血液检查及支气管镜因为有创性而难以被人们接受，而痰液脱落细胞则因为敏感性低而无法推广，且有研究表明，传统的肺癌诊断方法因依从性差对降低肺癌病死率贡献有限[4]。痰液及呼出气体都是无创诊断肺部疾病的理想样本，但呼出气体存在不易收集及运输的缺点，因而在无创诊断肺部疾病方面，痰液具有巨大优势因痰液富含与肺部疾病发生、发展相关的生物学信息，但由于敏感度低、可重复性差等缺点，痰液在肺癌诊断和筛查方面的临床运用受到了极大的限制[6,10-11]。

A：在LS1及LS2上的2D模式 PLS结果；B：在LS1及LS3上的2D模式 PLS结果； C：3D模式 PLS结果；D：主要差异性物质载荷图

离子肺癌组对照组P值m/z2380.73±0.4250.22±0.143<0.05m/z2794.44±1.0403.36±1.425<0.05m/z3489.64±1.5773.73±1.494<0.05m/z3790.73±0.4250.22±0.143<0.05m/z2512.10±1.6145.07±3.148<0.05m/z3914.06±1.9928.88±1.746<0.05m/z2742.47±0.9862.26±1.396>0.05m/z3740.04±0.0990.08±0.174>0.05

两组比较*P<0.05

质谱分析(MS)技术是一种敏感度高、特异度好、响应速度快的现代分析测试技术。质谱分析技术是主要是利用电场和磁场控制带电粒子的运动轨迹，并能根据粒子的质量及带电量将不同的带电粒子区分开(即质量与带电量比值相等的粒子会到达同一检测区域)，然后检测器能够获取粒子信息，从而获得带电粒子质谱指纹图谱。根据质谱指纹图谱的结果，可以分析出物质的质核比信息从而实现对待测物中某些粒子的定性与定量分析，已广泛应用于恶性肿瘤的诊断、分子标志物检测等领域。ND-EESI-MS[12]能够运用于黏稠液体的直接分析，已成功运用于牙膏、蜂蜜、化妆品等黏稠液体的分析。前期研究发现ND-EESI-MS能够对痰液进行直接分析并得到其内部的分子生物学信息[10]，本研究在前期研究基础上，对肺癌患者痰液及对照组痰液进行直接分析，以期发现肺癌痰液中与肺癌发生、发展相关的分子生物学信息。

应用ND-EESI-MS技术耦合PLS分析能够明显去区分两组样本一级质谱指纹图谱数据，且发现离子m/z238、m/z251、m/z274、m/z279、m/z348、m/z374、m/z379和 m/z391对区分两组样本的贡献较大。对比发现离子m/z238、m/z279、m/z348及m/z379在肺癌组痰液中的相对丰度明显高于对照组痰液，而离子m/z251及m/z391在对照组痰液中明显高于肺癌患者痰液，离子m/z274及m/z374的相对丰度在两组痰液样本中无明显差异。

运用ND-EESI-MS技术耦合PLS分析方法可以良好区分肺癌痰液与对照组痰液质谱指纹图谱数据并识别对区分贡献度大的差异性离子，可作为肺癌痰液鉴别的新方法，以期能在未来用于肺癌的诊断或筛查。但本研究仅找出差异性离子且样本量不是非常大，差异性离子的分子结构及差异性离子的生物学意义仍需进一步研究。