PKC信号通路在七氟醚预处理减轻心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用*

余美林， 顾云霞， 张静， 胡衍辉， 刘琴

南昌大学第二附属医院麻醉科(江西南昌 330006)

缺血预处理最早在心肌缺血再灌注损伤中发现具有保护作用[1]，不断增加的研究发现，吸入麻醉药预处理对心肌具有双重作用[2]。七氟醚因具有诱导迅速及苏醒快而完全，血流动力学稳定等优点广泛用于临床麻醉。已有研究表明七氟醚预处理通过线粒体ATP敏感性钾通道，参与心肌缺血再灌注时的氧化应激反应[3]，氧化应激在心肌缺血再灌注损伤中起着重要作用。Lee等[4]研究证实PKC信号通路与氧化应激反应密切相关，但是，目前在心肌方面的研究仍少见报道。2016年1月至2017年12月，本研究通过探讨七氟醚预处理通过PKC信号通路对心肌细胞缺氧复氧损伤的氧化应激影响，为明确其机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞的选择与分组 取对数生长H9c2心肌细胞购于中国科学院细胞库，将细胞随机分成5组(n=6):空白对照组(Sham组)，缺氧/复氧组(H/R组)，七氟醚预处理延迟性保护组(SWOP组)，PKC信号通路抑制剂组(CHE组)，CHE+SWOP组。

1.2 处理方法 Sham组细胞不进行特殊处理；H/R组细胞缺氧2 h后复氧1 h；SWOP组，先用2.5%七氟醚预处理20 min而后进行与H/R组相同的缺氧复氧，间隔24 h建立H/R模型；CHE组，在培养基内加入终浓度为10 μmol/L白屈菜赤碱培养1 h，间隔24 h后建立缺氧复氧模型；CHE+SWOP组，给予2.5%七氟醚预处理1 h前15 min在培养基内加入白屈菜赤碱，终浓度为10 μmol/L，间隔24 h后建立缺氧复氧模型。缺氧复氧方法如下：将细胞置于95%N2、5% CO2的培养箱中缺氧2 h而后放回95%空气、5%CO2的培养基中复氧1 h；七氟醚处理方法如下：将细胞置于无菌密闭容器中, 连接麻醉机呼吸环路，开启挥发罐调节七氟醚浓度为2.5%，持续20 min后在95%空气、5% CO2的培养基中洗脱10 min。

1.3 心肌细胞存活率测定 取处理后的心肌细胞，0.25%胰酶消化后得到单细胞悬液，用培养基调整细胞密度为5×104·mL-1，种入96孔板，每孔加入细胞悬液100 μL，37℃，5% CO2条件下培养24 h，使细胞贴壁。处理结束后加入MTT(5 g/L，溶于PBS)，每孔10 μL，37℃继续培养4 h后，小心吸去孔内MTT溶液，每孔加入200 μL DMSO终止反应，室温下，在摇床上轻微震荡10 min，使结晶物充分溶解，于酶联免疫检测仪上测定(波长为570 nm)各孔吸光度A值。空白对照孔不加细胞只加培养基，其他实验步骤同上。实验设10个复孔，取平均值。细胞存活率按以下公式计算：细胞存活率=各实验组吸光(A)度/空白对照组(A)吸光度×100%。

1.4 心肌细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量测定 取处理后的心肌细胞，利用试剂盒，采用二硫二硝基苯甲酸法检测GSH含量，硫代巴比妥酸显色法检测MDA含量。

1.5 心肌细胞内活性氧自由基(ROS)含量测定 取处理后的心肌细胞，利用ROS荧光探针二氢乙啶(DHE)测定各组心肌细胞内ROS的相对水平。DHE可穿透心肌细胞膜进入心肌细胞内，被胞内ROS氧化形成氧化乙啶，氧化乙啶可掺入细胞内染色体DNA，最终产生红色荧光。缺氧复氧末，于荧光显微镜下观察并拍摄心肌细胞红色发射图像(激发波长480～535 nm，发射波长590～610 nm)，红色荧光强度与ROS水平呈正相关。

1.6 抗氧化应激相关蛋白Nrf2及凋亡蛋白Caspase-3表达的测定 取处理后的心肌细胞，于缺氧复氧末，在心肌细胞中加入裂解液和磷酸酶抑制剂在超声下4℃匀浆裂解提取蛋白。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白样品的蛋白含量。取蛋白样品，电泳结束后牛奶封闭，加入一抗后孵育过夜，加二抗。行化学发光反应，测定蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 5组缺氧复氧末心肌细胞存活率比较 与Sham组相比，H/R组H9c2心肌细胞的存活率降低(P<0.05)；与H/R组比较，SWOP组心肌细胞的存活率升高，CHE组的心肌细胞存活率降低(P<0.05)；与SWOP组相比较，CHE+SWOP组心肌细胞存活率降低(P<0.05)。见表1。

2.2 5组缺氧复氧末心肌细胞内GSH及MDA含量比较 与Sham组比较，H/R组H9c2心肌细胞的GSH降低，MDA均升高(P<0.05)；与H/R组比较，SWOP组心肌细胞GSH升高，MDA降低(P<0.05)；与SWOP组相比较，CHE+SWOP组心肌细胞GSH降低，MDA升高(P<0.05)。见表2。

组别n细胞存活率Sham组496.5±1.9H/R组455.3±2.6∗SWOP组478.7±2.2△CHE组443.8±4.1△CHE+SWOP 组463.3±4.2▲

*与Sham组比较P<0.05；△与H/R组比较P<0.05；▲与SWOP组比较P<0.05

组别GSHMDASham组129.0±2.89.5±1.9H/R组84.2±2.6∗34.7±2.8∗SWOP组111.5±9.2△19.3±2.2△CHE组74.3±3.5△41.2±2.6△CHE+SWOP 组95.7±4.6▲24.5±1.9▲

*与Sham组比较P<0.05；△与H/R组比较P<0.05；▲与SWOP组比较P<0.05

2.3 缺氧复氧末各组心肌细胞ROS含量 与Sham组比较，H/R组H9c2心肌细胞的ROS含量升高(P<0.05)；与H/R组比较，SWOP组心肌细胞的ROS含量降低，CHE组的ROS含量升高(P<0.05)；与SWOP组相比较，CHE+SWOP组心肌细胞的ROS含量升高(P<0.05)。见表3、图1。

组别nROSSham组492.00±2.58H/R组4228.75±16.52∗SWOP组4141.25±6.50∗△CHE组4255.00±19.15∗▲CHE+SWOP 组4186.00±7.53△▲

*与Sham组比较P<0.05；△与H/R组比较P<0.05；▲与SWOP组比较P<0.05

*与Sham组比较P<0.05；△与H/R组比较P<0.05；▲与SWOP组比较P<0.05

图1缺氧复氧末各组心肌细胞ROS含量

2.4 5组缺氧复氧末心肌细胞内Nrf2和Caspase-3含量比较 与Sham组比较，H/R组H9c2心肌细胞Nrf2蛋白表达上调(P<0.05)；与H/R组比较，SWOP组Nrf2蛋白表达进一步上调，CHE组的Nrf2蛋白表达下调(P<0.05)，与SWOP组比较，CHE+SWOP的Nrf2蛋白表达下调(P<0.05)；与Sham组比较，H/R组H9c2心肌细胞Caspase-3蛋白表达均上调(P<0.05)；与H/R组比较，SWOP组Caspase-3蛋白表达下调，CHE组Caspase-3蛋白表达进一步上调(P<0.05)；与SWOP组相比，CHE+SWOP组的Caspase-3蛋白表上调(P<0.05)。表4、图2～3。

组别Nrf2Caspase-3Sham组1.03±0.171.00±0H/R组3.20±0.49∗3.08±0.10∗SWOP组5.20±0.41∗△1.93±0.10∗△CHE组2.20±0.16∗▲3.40±0.08∗▲CHE+SWOP 组4.01±0.25∗△▲2.60±0.32∗△▲

*与Sham组比较P<0.05；△与H/R组比较P<0.05；▲与SWOP组比较P<0.05

3 讨论

体外循环技术不可避免出现心肌缺血再灌注损伤，缺血心肌在恢复血流灌注的过程中，其功能障碍和结构损伤进一步加重，导致机体心功能恶化，血流动力学紊乱，心肌梗死面积增加，因此，如何有效地减轻心肌细胞缺氧复氧损伤，仍为近年来研究重点。本研究参照文献[5-6]将H9c2心肌细胞置于95%N2、5% CO2的培养箱中缺氧2 h而后放回37℃、5%CO2的培养基中复氧1 h的方法，建立心肌缺血再灌注损伤模型，结果表明，与Sham组比较，H/R组H9c2心肌细胞存活率显著升高，提示模型制备成功。

*与Sham组比较P<0.05；△与H/R组比较P<0.05；▲与SWOP组比较P<0.05

图2 5组缺氧复氧末心肌细胞内Nrf2含量的表达

*与Sham组比较P<0.05；△与H/R组比较P<0.05；▲与SWOP组比较P<0.05

图3 5组缺氧复氧末心肌细胞内Caspase3含量的表达

参照文献[5,7]的方法，将细胞置于密闭容器内通入2.5%七氟醚维持1 h后间隔24 h再建立H/R模型，结果表明，与H/R组比较，SWOP组细胞存活率明显升高，证明了2.5%七氟醚预处理对缺血心肌的保护作用。

研究表明，氧化应激是心肌缺血再灌注损伤的重要机制[8]，心肌再灌注损伤后，体内氧化抗氧化系统失衡，功能障碍的线粒体产生大量氧自由基和超氧阴离子，进而引起脂质过氧化反应。其中MDA作为脂质过氧化的终末代谢产物，其含量反映细胞遭受氧化应激的严重程度。心肌缺血再灌注产生ROS，ROS能与脂质反应生成H2O2与烷氧自由基，使脂质氧化，而高浓度的ROS可通过细胞氧化应激反应导致细胞凋亡直至死亡。而Caspase-3作为Caspase家族的核心效应因子，是细胞凋亡的主要执行者。另外，在机体的抗氧化系统中，GSH是一种抗氧化剂，研究表明，GSH能释放电子给高活性的活性氧簇进而清除活性氧簇，防止蛋白质等大分子被活性氧簇氧化，进而抗氧化应激[9]。Nrf2作为一种中枢转录因子，同样在机体的内源性抗氧化途径中发挥着至关重要的作用。本研究结果表明，与H/R组相比，SWOP组心肌细胞MDA含量降低，ROS水平降低，Caspase-3蛋白表达下调，抗氧化指标GSH，Nrf2水平增加，提示七氟醚预处理后可通过抑制心肌脂质过氧化反应，增强抗氧化能力，发挥心肌保护作用，从而改善心肌细胞缺氧复氧损伤时的氧化应激反应。

PKC信号通路是心肌缺氧复氧损伤的重要保护机制之一[10]。PKC能够通过磷酸化Nrf2激活抗氧化反应元件，参与氧化应激反应[11]。也有研究表明，调节PKC活性可介导心肌的保护作用[12]；Lee等[4]表明PKC信号通路参与七氟醚预处理调节氧化应激水平，减少大鼠脑缺血再灌注损伤，发挥保护作用。本研究参照文献[13]的方法，采用终浓度为10 μmol/L的白屈菜赤碱干预来抑制PKC信号通路，结果表明，与H/R组相比，CHE组心肌细胞存活率降低，心肌细胞GSH含量降低，MDA含量增加，ROS含量增加，Nrf2含量降低，Caspase-3含量增加，证明了PKC信号通路是参与了缺氧复氧损伤心肌细胞的氧化应激保护作用，为了进一步验证七氟醚预处理的心肌保护作用是否也与PKC信号通路有关，本研究在给予2.5%七氟醚预处理1 h前15 min在培养基内加入白屈菜赤碱，终浓度为10 μmol/L，间隔24 h后建立缺氧复氧模型。结果表明，给予PKC抑制剂后，相比于SWOP组，其心肌细胞存活率下降，GSH含量下降，ROS含量增加，Nrf2降低，凋亡蛋白Caspase-3表达增加。其心肌保护效应降低，提示PKC信号通路的激活，参与了七氟醚预处理的心肌保护作用。其机制可能为PKC广泛的下游作用有关，KATP是其主要的作用位点[14-15]，活化的PKC直接或间接开放KATP通道，扩大信号分子的级联反应，而KATP的激活在七氟醚预处理或者后处理的机制中均起着重要的作用，七氟醚通过刺激KATP的开放抑制活性氧爆发，影响下游的细胞增殖，减少细胞凋亡及相关蛋白的表达。

综上所述，七氟醚预处理可减轻心肌细胞缺氧复氧损伤，PKC信号通路可能参与了心肌细胞缺氧复氧时抗氧化应激的保护作用。