他汀类药物联合抗结核病药导致大鼠肝损伤

喻明丽，刘梦醒，罗 季，陈 洁，彭江丽

(昆明市第三人民医院药学部，昆明 650041)

云南省属于结核病高发地区之一。昆明市第三人民医院是以传染病治疗为特色的综合性医院。在临床实际工作中，结核病合并高脂血症患者采用抗结核病药联合他汀类药物降血脂治疗较常见，该类联合用药在治疗过程中常常会出现不同程度的药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)。此类问题越来越受到临床医师的关注，并已成为影响临床疗效的主要原因之一。本研究通过复制阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀分别与抗结核病药联用致大鼠肝损伤模型，检测大鼠肝功能生化指标并进行电镜观察，以探讨不同他汀类药物分别联合抗结核病药致大鼠肝损伤的特点，为临床合理用药提供理论依据。

1 材 料

1.1 实验动物 SPF级8周龄Sprague Dawley(SD)大鼠80只，雌雄各半，体质量180～220 g，由昆明医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证号SCXK(滇)K2015-0002。饲养条件：室温23～25 ℃，湿度30%～70%，自由进食、饮水。

1.2 仪器和试药 AU5400全自动生化分析仪(日本Olympus公司)；JEM1011透射电子显微镜(日本微电子Microjenics株式会社)。辛伐他汀片(批号130922，美国默沙东医药公司)；洛伐他汀片(批号131011，山东罗欣药业集团股份有限公司)；阿托伐他汀钙片(批号130820，辉瑞制药有限公司)；异烟肼片(批号 130108，西南药业股份有限公司)；利福平胶囊(批号130823，云南昊邦制药有限公司)；吡嗪酰胺片(批号131003，成都锦华药业有限公司)。

2 方 法

2.1 实验动物分组 80只SD大鼠按随机数字表法分为4组：空白对照组、阿托伐他汀+联合抗结核病药(异烟肼+利福平+吡嗪酰胺，下同)组、辛伐他汀+联合抗结核病药组、洛伐他汀+联合抗结核病药组，每组20只，雌雄各半。

2.2 动物模型制备

2.2.1 给药剂量换算 按成人体质量70 kg进行人-鼠间给药剂量换算[1]，大鼠每日用量(mg/kg)=成人每日用量(mg/kg)×6.25(换算系数)。从灌胃开始，每周测定一次大鼠体质量，并以此作为给药剂量换算的依据，按药物配制表(见表1)配制药物水性混悬液进行灌胃。

2.2.2 动物给药 空白对照组灌胃生理盐水2 ml/100 g体重；其他组先灌胃抗结核病药， 4 h后再灌胃他汀类药物，每天灌胃1次，灌胃容量2 ml/100 g体重。

表 1 药物配制剂量换算表Table 1 Dosage conversion table of the drug preparation

2.3 肝功能生化指标检测 实验大鼠于给药第10天(d 10)、d 35、d 55分别处死6只、6只和8只，雌雄各半。处死前抽取静脉血5 ml，用全自动生化分析仪立即检测总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)、间接胆红素(IBil)、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酸氨基转移酶(ALT)水平。根据2015版中华医学会《药物性肝损伤诊治指南》[2]判断是否存在DILI及DILI类型。各用药组的肝功能生化指标与空白对照组比较有统计学差异，表示存在DILI。用R值判定肝损伤类型。R=(ALT实测值/ALT正常值上限)/(ALP实测值/ALP正常值上限)。R≥5为肝细胞损伤型，R≤2为胆汁淤积型，2

2.4 电镜观察 处死大鼠，于每只大鼠相同部位取肝脏组织并制作电镜切片，电子显微镜下观察肝细胞器超微结构的损伤情况。

3 结 果

3.1 肝功能生化指标 给药d 10、d 35、d 55，与空白对照组比较，各联合给药组TBil、DBil和IBil显著升高(P<0.01)。给药d 10、d 35、d 55，阿托伐他汀+联合抗结核病药组、辛伐他汀+联合抗结核病药组与空白对照组比较,AST显著升高(P<0.01)。给药d 35，阿托伐他汀+联合抗结核病药组、辛伐他汀+联合抗结核病药组与空白对照组比较,ALT显著升高(P<0.01)。给药d 55，阿托伐他汀+联合抗结核病药组与空白对照组比较，ALT显著升高(P<0.01)。给药d 35、d 55，阿托伐他汀+联合抗结核病药组、辛伐他汀+联合抗结核病药组分别与空白对照组比较，ALP显著升高(P<0.01)。d 35、d 55辛伐他汀+联合抗结核病药组、洛伐他汀+联合抗结核病药组分别与阿托伐他汀+联合抗结核病药组比较，ALP显著升高(P<0.01)，具体见表2。

3.2 肝损伤类型 3组他汀类药物+联合抗结核病药组分别在给药d 10、d 35、d 55R值<2，提示3组均主要以胆汁淤积型肝损伤为主。

3.3 大鼠肝脏电镜观察结果 空白对照组：电镜显示线粒体数量多，呈圆形或椭圆形，形态正常；粗面内质网较多；滑面内质网较少，未见大量增生；细胞核大而圆，核仁清晰，其他无异常(见图1的A、B、C)。阿托伐他汀+联合抗结核病药组：给药d 10肝细胞轻度水肿，部分肝细胞脂变，血窦瘀血；d 35肝细胞脂变，血窦扩张瘀血；d 55肝细胞明显变性、血窦扩张明显，局部肝组织提示肝纤维化(见图1的D、E、F)。辛伐他汀+联合抗结核病药组给药d 10肝细胞明显脂变，胶原纤维增生;给药d 35、d 55肝细胞浆有明显空泡样改变，出现胆汁淤积，并随用药时间延长淤积更严重(见图1的G、H、I)。洛伐他汀+联合抗结核病药组给药d 10血窦明显扩张，瘀血，细胞固缩，变性坏死;d 35有脂滴，细胞轻度水肿;d 55线粒体固缩，细胞水肿，滑面内质网增生(见图1的J、K、L)。

组别动物数(n)总胆红素(cB/μmol·L-1)直接胆红素(cB/μmol·L-1)间接胆红素(cB/μmol·L-1)天冬氨酸氨基转移酶(zB/U·L-1)谷氨酸氨基转移酶(zB/U·L-1)碱性磷酸酶(zB/U·L-1)空白对照组 d 1067.78±0.382.70±0.105.08±0.38143.33± 4.08 33.83±3.31182.00±8.88 d 3568.06±0.382.82±0.125.24±0.46173.67±39.9844.17±2.32200.00±1.79 d 5588.13±0.582.89±0.195.31±0.56181.01± 7.9856.00±2.73208.86±5.47洛伐他汀+联合抗结核病药组 d 10610.67±0.59∗∗3.62±0.18∗∗7.05±0.44∗∗160.83±30.1936.17±5.42194.83±27.84 d 35610.99±0.77∗∗3.70±0.35∗∗7.29±0.42∗∗196.00±19.4173.25±15.95221.50±25.96△△ d 55810.89±0.73∗∗3.67±0.32∗∗7.22±0.60∗∗199.99±28.2576.95±16.64233.47±27.35△△辛伐他汀+联合抗结核病药组 d 10610.23±0.37∗∗3.51±0.16∗∗6.73±0.32∗∗179.83±11.64∗∗40.00±2.52212.17±18.09 d 35610.06±0.42∗∗3.43±0.28∗∗6.64±0.50∗∗231.83±19.11∗∗68.5±5.44∗∗254.00±18.65∗∗△△ d 55810.16±0.50∗∗3.51±0.40∗∗6.65±0.49∗∗227.88±15.96∗∗63.33±6.78267.45±18.63∗∗△△阿托伐他汀+联合抗结核病药组 d 10610.25±0.34∗∗3.39±0.24∗∗6.86±0.48∗∗208.00±42.21∗∗39.83±12.50205.17±72.37 d 35610.38±0.40∗∗3.38±0.28∗∗7.00±0.50∗∗213.00±24.03∗∗78.50±15.71∗∗377.83±78.66∗∗ d 55810.19±0.63∗∗3.40±0.36∗∗6.80±0.52∗∗208.96±22.69∗∗80.59±18.57∗∗391.97±83.49∗∗

**P<0.01，与同时间空白对照组比较;△△P<0.01，与同时间阿托伐他汀+联合抗结核病药组比较

图 1 大鼠肝细胞病理变化的电镜照片Figure 1 Electron micrograph of pathological changes in rat liver cellsA、B、C：空白对照组用药d 10、d 35、d 55取材；D、E、F：阿托伐他汀+联合抗结核病药组用药d 10、d 35、d 55取材；G、H、I:辛伐他汀+联合抗结核病药组用药d 10、d 35、d 55取材；J、K、L:洛伐他汀+联合抗结核病药组用药d 10、d 35、d 55取材

4 讨 论

DILI的发生通常与药物本身的化学性质、剂量、疗程、药物相互作用以及药物的代谢密切相关,同时也与患者肝脏对药物的耐受性、适应性及敏感性息息相关[2]。DILI的发病机制较为复杂，往往是多种机制并存、先后作用或共同作用的结果。他汀类药物致DILI的机制目前仍不明确。张守堂等[3]的研究表明，他汀类药物自身或其代谢产物主要通过影响肝细胞分泌胆汁，使有些药物与胆小管转运蛋白结合后导致肝内胆汁淤积。

本研究中生化指标结果显示，大鼠的肝损伤主要表现为胆汁淤积型，且随着用药时间的延长有加重趋势，提示临床应及时和定期监测患者肝功能，一旦出现DILI应给予促胆汁排泄类保肝药，必要时给予暂时停药处理。本课题组前期研究均显示[4-6]，他汀类药物与抗结核病药联用后，肝细胞表面和周围都存在着大量胆汁淤积，这也间接验证了这种损伤机制的存在。本研究结果还显示，联合用药后大鼠肝细胞线粒体均出现不同程度水肿、崩解和坏死等病变。由于线粒体是真核细胞能量供应和新陈代谢的主要场所，其损伤必定会导致细胞能量耗竭，引起细胞凋亡和坏死[7]。由于抗结核病药物也主要经过肝脏代谢，当他汀类联用抗结核病药时，其中利福平为肝药酶CYP3A4强效诱导剂，其不仅能加强异烟肼和吡嗪酰胺本身及代谢产物的肝毒性，而且还能诱导主要经肝药酶CYP3A4代谢的他汀类药物代谢产物增加，进而加重肝损伤。

本研究结果表明，用药d 35、d 55，联合用药组均发生不同程度的肝损伤，其中以阿托伐他汀+联合抗结核病药组的肝损伤较重。针对结核病合并高脂血症患者，提示临床选药时应尽量避免阿托伐他汀联用抗结核病药治疗。有研究发现[8]，他汀类药物在抑制羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的同时，使线粒体甲羟戊酸盐代谢途径中多种中间产物受抑制，导致细胞能量耗竭，进而死亡。而且在体外实验中发现，阿托伐他汀的邻位和对位羟基化代谢产物对HMG-CoA还原酶的抑制作用与原药相当[9]，而辛伐他汀和洛伐他汀的代谢产物均不抑制HMG-CoA还原酶。因此，阿托伐他汀对HMG-CoA还原酶抑制剂作用为双重抑制，而辛伐他汀和洛伐他汀为单一抑制，这也可能是阿托伐他汀+联合抗结核病药组较辛伐他汀、洛伐他汀联合用药组肝损伤严重的原因之一。

总之，DILI的机制复杂，还有待逐步深入研究。本课题组仅从生化指标和电镜观察的角度研究了DILI的可能机制，不能完全深入和明确地解释肝损伤的机制，还需要进一步地从药物基因组学等多角度、多细节进行实验设计和研究。