新疆南疆绵羊牛无浆体病的流行病学调查

桂成坤 林留霞 张晶 宋倩倩 石长青 王新疆 李莲瑞,2*

（1 塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔843300）

（2 塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300）

（3 第二师二二三团农业发展服务中心，新疆库尔勒841308）

无浆体（Anaplasma）是一类经蜱传播的专性细胞内寄生菌，主要寄生于牛羊等反刍动物的血细胞中［1］。已知的无浆体病原包括绵羊无浆体（A.bovine anaplasm）、中央无浆体（A. centrale）、牛无浆体（A.bovine anaplasm）、嗜吞噬细胞无浆体（A. phagocytophilum）和扁平无浆体（A.platys）［2］。1982 年，在新疆和内蒙古无浆体病被首次报道［3］。该病可引起动物体重下降，流产，产奶量下降，严重者导致死亡，造成严重的经济损失［4］，鉴于此，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须通报的疫病，也是我国出入境动物检疫对象之一［5］。牛无浆体病可根据流行病学和临床症状来做出初步判断，然后将牛无浆体进行姬姆萨染色确诊。由于血涂片染色法在感染率低或感染早期很难在显微镜下检查出病原，因而需要进行分子生物学诊断。其中PCR 检测方法检出率高，特异性强、敏感性高［6］，但在某些情况下，一对引物扩增的产物仍不足以通过凝胶检测观察到，故本实验采用巢式PCR 方法。由于无浆体病的传播受媒介蜱的影响较大，具有较强的季节性，6 月份出现，8～10 月流行［7］，因此本次实验于9 月开始采集南疆阿克苏、和田、喀什和巴州四个地区共637 只绵羊的全血样品，采用巢式PCR法，以16S rRNA基因作为靶基因，对这些地区绵羊的牛无浆体病的流行状况进行调查。此次实验可为我国新疆南疆地区绵羊牛无浆体病的诊断和防控提供流行病学资料。

1 材料

1.1 血液样品的采集

2016年9月，采集南疆阿克苏、和田、喀什和巴音郭楞自治州四个地区共计637 只绵羊的抗凝血，于4 ℃保存备用，样品分布详细见表1。

表1 南疆四地州绵羊血液采集统计表

1.2 主要试剂和仪器

试剂：Gold view 染料购自苏州金唯智生物科技有限公司，dNTP Mixture 购自北京全式金生物技术有限公司，全血DNA 快速提取试剂盒和DL2000 Marker购自北京华大生物科技有限公司，Agarose 购自北京沃比森科技有限公司。

仪器：净化工作台产自上海博讯实业有限公司医疗设备厂，涡旋混合器产自金坛市医疗仪器厂，高压灭菌锅产自HIPAYAMA 公司，电泳槽产自北京六一仪器厂，凝胶成像系统产自BIO-RAD公司，PCR扩增仪产自Biometra公司。

2 方法

2.1 样品DNA的提取和巢式PCR扩增

按照北京华大生物科技有限公司的全血基因组DNA 快速提取试剂盒的说明书提取羊全血DNA。参考Kawahara Makoto［8］等人的论文设计牛无浆体的引物序列，牛无浆体的引物是由苏州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列如表2 所示。其中第一套上游引物为AB1，第一套下游引物为AB2；第二套上游引物为AB3，第二套下游引物为AB4。

表2 牛无浆体引物序列

巢式PCR 扩增体系为：DNA 模板1 µL；上游引物AB1/AB3 和下游引物AB2/AB4 各0. 3 µL；dNTP Mixture 12. 5 µL，加入ddH2O 补至25 µL。第一轮PCR 扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；35 个循环；72 ℃再延伸8 min。第二轮PCR 扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；40个循环；72 ℃再延伸10 min。

2.2 感染情况统计

巢式PCR 扩增出目的条带的样品为阳性样品，阳性样品表示绵羊感染牛无浆体，统计四个地区绵羊牛无浆体的感染情况。

3 结果

3.1 巢式PCR电泳结果

经PCR 扩增后得到一条551 bp 的目的条带，与预期结果一致，部分样品电泳结果如图1所示。

图1 绵羊感染牛无浆体部分样品的PCR结果

3.2 感染结果

经统计，喀什地区的绵羊牛无浆体感染率为55. 3%，各县、市绵羊的牛无浆体感染情况如表3 所示；巴州地区的感染率

为43. 3%，各县、市绵羊的牛无浆体感染情况如表4 所示；和田地区的感染率为53. 3%，各县、市绵羊的牛无浆体感染情况如表5 所示；阿克苏地区的感染率为51.3%，各县、市绵羊的牛无浆体感染情况如表6所示。

表3 喀什地区绵羊的牛无浆体感染情

表4 巴州地区绵羊的牛无浆体感染情

表5 和田地区绵羊的牛无浆体感染情

表6 阿克苏地区绵羊的牛无浆体感染情

4 讨论

巢式PCR 检测方法，敏感度高、特异性强，是目前检测和诊断羊无浆体病的较为普遍的方法。16S rRNA 基因具有一定的保守性，根据MSP4 基因和16S rRNA 基因设计、合成引物，选择巢式PCR 方法检测，检测结果更精准有效。

牛无浆体的传播媒介主要是钝缘蜱、扇头蜱、璃眼蜱和血蜱等几个属，由表6可知温宿县绵羊牛无浆体的感染率高达81.8%，是所有县市中感染率最高的县，这与刘永宏调查的温宿县蜱的流行情况相吻合，据刘永宏［9］调查结果显示该地方主要流行的蜱是钝缘蜱、扇头蜱属，但其他蜱属均有发现，并且该地方的蜱密度高，绵羊感染率高，所以该地方的绵羊牛无浆体的感染率也非常高。

喀什地区的12 个县、市绵羊的牛无浆体的总阳性率为55.3%，是四个地区中感染率最高的地区，根据刘永宏［9］调查结果喀什地区羊蜱优势属类为璃眼蜱属和钝缘蜱属，都是牛无浆体的主要传播媒介，并且喀什地区的养殖技术落后和非规模化的养殖模式居多，防疫工作较难落实，导致该地区的蜱虫感染率高，使得牛无浆体的感染率处于较高水平；并且可以看出，沿叶尔羌河流域的周边几个县的感染率都比较高，因为该地区水草丰茂，有利于蜱的生长繁殖，进一步加剧了牛无浆体的感染。

和田策勒县的感染率为53.3%，在和田地区只采取这一个县的样品故和田地区的感染率数据尚不完善。刘永宏［9］调查结果显示和田地区策勒县羊蜱优势属类为扇头蜱属和血蜱属，也是牛无浆体的主要传播媒介，所以该县的感染率也达到50%以上。

巴州地区绵羊的牛无浆的总体感染率为43.3%，相比较喀什及和田地区的感染率要低很多，因为该地区相较于喀什和和田地区得养殖技术相对先进，养殖模式也相对集约化规模化，蜱虫的防控工作也相对完善。

新疆南疆绵羊的牛无浆体的总体感染率为52.9%，在新疆南疆地区不同的地区绵羊的牛无浆体感染率不相同，同一地区不同的县、市绵羊的牛无浆体的感染率也各不相同，通过代艳艳［10］人对新疆南疆地区牛羊寄生蜱类调查可知至少有数十种以上的蜱可引起动物的牛无浆体病发生，其中能使羊发生牛无浆体病的蜱主要有扇头硬蜱、草原革蜱、璃眼蜱等，而在新疆南疆地区的羊的硬蜱科主要有八个属，软蜱科主要有两个属，其中扇头蜱属和璃眼蜱属在新疆南疆地区存在最多。闻秀秀［11］等调查可确定银盾革蜱及边缘革蜱为无浆体的媒介蜱。由于新疆南疆地区的气候干燥，夏季温度较高，适宜蜱的生长，蜱类在新疆南疆各个地区都有存在，且蜱类存在的种类和数量没有较大的差异，故新疆南疆绵羊的牛无浆体在各个地区都有感染。张菲菲［12］等应用PCR检测法对中国河南、内蒙、辽宁、山西、山东、云南绵羊和山羊血液样品进行无浆体检测，结果表明牛无浆体的感染率为30.15%。迟庆安［6］等研究的调查结果显示，四川省、重庆市、云南省、贵州省、湖南省、广西壮族自治区、广东省七省（区、市）牛无浆体阳性率分别为17.5%、25.7%、29.6%、59.1%、8.2%、14.0%和23.7%，总体阳性率为25.1%。而新疆南疆地区的感染率为52.9%，较我国中东部地区和南方七省感染率高出许多。

无浆体病对养羊业危害较大，绵羊感染无浆体病后多引起增重缓慢，饲料报酬降低，流产，病情转急发作时也会造成死亡，给绵羊养殖业造成严重的经济损失，可引起人和动物贫血、黄疸、胆囊肿大、消瘦等临床症状，应该重视此病。本病的防治原则主要是切断传播途径，加强驱蜱灭蜱等蜱虫防控工作，避免易感动物被蜱等传播媒介叮咬，增强易感动物的免疫力等。本次实验结果丰富了新疆南疆地区绵羊的牛无浆体的流行病学资料，并为南疆四地州的绵羊的牛无浆体病的防控提供参考数据。