CdSe/ZnS量子点的合成及对阿萨尔吉亚芽孢杆菌标记

王小龙 曾红

（新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室/塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300）

量子点也叫化学探针，一般是由II-Vl族或III-V族元素组成的微观粒子（粒径在1～10 nm［1］），具有荧光强度高，物理化学性质稳定的特点。量子点可分为单核型和核壳型，单核型量子点有CdSe、ZnS［2］、CdTe［3］，核 壳 型 量 子 点 有CdSe/ZnS［4］，CdS/ZnS［5］，CdSe/CdS［6］等。

据文献报道，量子点可作为荧光标记探针用于标记人体干细胞［7］，还能标记植物DNA 上，用于植物生长发育研究［8］。关于量子点用于细菌的标记，也有许多报道，如CdSe/CdZnS 核壳型量子点成功标记在大 肠 杆 菌 上［9］；CdSe 量 子 点 标 记 荧 光 假 单 孢 菌（Pseudomonas fluorescensBA3SM1）［10］；CdTe 和CdTe/ZnS 量子点标记在大肠杆菌（Escherichia coliDH5a）、李斯特氏菌（Listeria monocytogenesCMCC54002）、表皮 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus epidermidisCMCC269069） 、变 形 杆 菌（Proteus vulgarisCMCC49027）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosaATCC 27853）、沙门氏菌（Salmonella paratyphiACMCC（B）50093）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、沙雷氏菌属（Serratia sp）枯草芽孢杆菌B168［11］；复合型CdSe/ZnS量子点标记在革兰氏阴性菌E.coli［12］。而关于CdSe/ZnS 量子点标记在阿萨尔基芽亚孢杆菌上的研究未见报道。

目前有多种合成CdSe/ZnS 的方法，在有机相中合成量子点条件苛刻，原料药价格高、生物相容性差、而且毒性非常大，且化学方法合成的量子点需要引入水溶性的基团，增加量子点的水溶性并提高其生物相容性。本文基于高艳丽等报道的方法［13-14］先合成CdSe 量子点再合成CdSe/ZnS 量子点，并对其进行结构修饰，以提高量子点水溶性和生物相容性。

近年来，量子点因化学稳定性好、荧光强度强在食品、药物、微生物领域应用广泛，本文合成CdSe/ZnS，标记对棉花黄萎病菌具有拮抗效果的阿萨尔基亚芽孢杆菌，为观测其在棉田定殖动态提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试试剂与药品

硒粉，硼氢化钠，氯化镉，L-半胱氨酸，硫酸锌，硫化钠，巯基乙酸（MAA），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC），巯基丙酸（MPA），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）均为分析纯，购于天津市光复精细化工研究所。

1.2 供试菌株

阿萨尔基亚芽孢杆菌（Bacillus axarquiensisTUBP1），由兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室提供。

1.3 方法

1.3.1 CdSe量子点的合成方法

先制备前驱体NaHSe，在50 mL 圆底烧瓶中迅速加入双蒸水2.0 mL 和0.040 0 g NaHB4，震荡溶解，然后再加入Se 粉，使二者的比例变为1∶2，Se 粉过量，抽真空，通入氮除氧，在氮气保护下反应大约2.0 h。先得到前驱体NaHSe 颜色为无色透明。同时量取120 mL 双蒸水加入250 mL 的圆底烧瓶中，也是在氮气的保护下加入CdCl2（0. 015 4 g）和巯基乙酸（18 µL MAA），调节溶液的pH 至8.0，在隔绝氧气条件下反应30 min，迅速加入新制备的NaHSe，每隔20 min 取样。有关方程式如下：

1.3.2 CdSe/ZnS量子点的合成方法

根据Chan等报道的方法［15-17］，取60 mL制备好的CdSe 量子点，同时滴加Na2S 和ZnSO4溶液（在无氧的条件下进行），在温度为50 ℃反应1 h，得到CdSe/ZnS量子点，量子点浓度以溶液中Cd2+含量计算。最后取CdSe/ZnS核壳型量子点20 mg溶于1.0 mL氯仿中，再加入100µL 0.1 mol/L 的巯基丙酸，搅拌过夜。将溶液洗涤干燥后所得的量子点即为水溶性的巯基丙酸修饰的CdSe/ZnS核壳型量子点［18-19］。

1.4 量子点标记阿萨尔基亚芽孢杆菌

1.4.1 细菌培养和计数

阿萨尔基亚芽孢杆菌（B.axarquiensisTUBP1）由兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室提供。B.axarquiensisTUBP1接种于NA培养基上，放置在37 ℃恒温箱培养48 h，并通过平板计数法［19-20］调整菌悬液浓度为1×107CFU/mL。

1.4.2 量子点标记阿萨尔基亚芽孢杆菌

1）阿萨尔基亚芽孢杆菌菌悬液4 000 r/min 离心5～10 min，收集菌体，PBS 洗涤2～3 次，通过稀释平板法计数。取200µL菌悬液加入偶联剂EDC 100µL（浓度为1 mg/mL），搅拌15 min 之后，再加入另外一种偶联剂NHS 100 µL（浓度为0. 15 mg/ml），置于37 ℃的摇床继续反应1.5 h，以不加偶联剂者为对照组。待反应完毕后离心收集菌体，无菌水洗涤3～5遍，菌体重新悬于500µL 无菌水用于流式细胞仪进行定量分析。

2）先 将100 µL 浓 度 为1 mg/mL 的EDC 加 入200 µL 不同浓度的量子点中，搅拌15 min。再加入0. 15 mg/mL 的NHS 100 µL，反应20 min。最后将上述溶液与细菌（细菌的挑取与菌液的制备与上述步骤相同）在37 ℃孵育10～70 min，0.22µm 超滤膜过滤，收集滤液，以不加粘结剂（EDC/NHS）者为空白对照。取500µL菌液用于流式细胞仪进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 CdSe量子点的结果分析

2.1.1 反应时间对CdSe荧光强度的影响

紫外-可见分光光光度计和荧光分光光度计检测反应时间对CdSe 量子点荧光强度的影响，如图1和图2所示。

图1 反应时间对CdSe 量子点的紫外-可见吸收光谱的影响a-g分别为20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min

图2 反应时间对CdSe量子点荧光强度的影响a-g分别为20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min

由图1 可知，CdSe 量子点在紫外可见区有明显吸收峰，从紫外可见吸收峰特征可以初步判断合CdSe 成量子点合成成功，且随着反应回流时间的不断延长，吸收峰有红移现象，预示量子点纳米粒径逐步变大。由图2 可知，反应时间延长，量子点的荧光强度减弱，当时间达到140 min 时，发射波长峰的位置无明显变化，且荧光强度也减弱，这可能是合成的量子点出现了缺陷，影响荧光强度。反应20 min 时，虽然荧光强度比较强，但是紫外吸收峰较宽，综合考虑，本实验选择NaHSe 和CdCl2反应时间为40 min。

2.1.2 合成温度对CdSe荧光强度的影响

考察反应温度（20 ℃，30 ℃，60 ℃和90 ℃）对CdSe 量子点荧光强度的影响，其他反应条件相同，分别为反应时间40 min，Cd∶Se 配比为2∶1，加入MAA 的量为18 µL。由图3 和图4 可知，当其他反应条件相同（时间40 min、Cd∶Se 配比为2∶1，加入MAA 的量为18µL）时，随着温度的升高，合成的量子点吸收峰位置向长波方向移动，且荧光强度也相应减弱。但是温度太低时，反应速率会比较慢。因而确定最佳反应温度为30 ℃。

图3 反应温度对CdSe量子点紫外-可见吸收光谱的影响

图4 反应温度对CdSe 量子点荧光强度的影响

2.1.3 pH值对CdSe荧光强度的影响

由图5可知，当溶液的pH 值大于8.0时，随着pH值的升高，量子点的荧光强度会逐渐降低，而pH 值小于8.0 时，荧光强度也会下降。荧光强度在pH 为8.0时达到最高值，所以选择最佳反应pH为8.0。

图5 pH对CdSe量子点荧光强度的影响温度30 ℃，Cd:Se=2:1，反应时间40 min

2.1.4 最佳Cd∶Se配比对CdSe荧光强度的影响

根据以上实验的结果，固定加入巯基乙酸（MAA）的量，当反应温度为30 ℃，回流时为40 min，改变Cd∶Se 物质的量之比（1∶1、2∶1、3∶1），选择最佳的Cd∶Se 配比。由图6 可知，其他条件一致的情况下，Cd 量减少时，量子点荧光强度随之减弱，当Cd∶Se 比例为1∶1 时，溶液有沉淀析出，无法得到较好的量子点，当Cd∶Se 配比为2∶1 时，能得到亮黄色透明溶液，且能保存数月。当Cd∶Se 配比为3∶1时，合成出来的量子点也具有较强荧光，但是不及Cd∶Se 配比为2∶1 的荧光强度。综合考虑，最佳Cd∶Se 配比确定为2∶1。

图6 Cd:Se比例对CdSe量子点荧光强度的影响

稳定剂对量子点的影响十分大，本文选取巯基乙酸（MAA）作为稳定剂，合成CdSe水溶性量子点，并对探究一系列因素（Cd∶Se 物质的量配、反应温度、回流时间、溶液的pH 等）对CdSe 量子点荧光强度的影响。结果如图6 可知，Cd∶Se 的物质量摩尔比为2∶1，温度为30 ℃，时间为40 min，pH 为8 时，合成的量子点荧光强度稳定，分散性好，且合成的量子点的荧光峰在550 nm，测定时的激发波长为420 nm。

2.2 CdSe/ZnS量子点

由图7 可知，核壳型量子点CdSe/ZnS 在450 nm处有最大吸收峰，核壳型量子点特征吸收比较明显。

2.3 量子点标记阿萨尔基亚芽孢杆菌结果

量子点标记阿萨尔基亚芽孢杆菌结果如图8 所示，CdSe 和CdSe/ZnS 量子点标记阿萨尔基亚芽孢杆菌分别9%和10%（8A-B），核壳型CdSe/ZnS 量子点标记率略高于单核型CdSe量子点。CdSe/ZnS量子点按照阿萨尔吉亚芽孢杆菌菌液→加入量子点→加入EDC→加入NHS→加入PBS顺序进行标记，标记率为15%，而按照EDC→加入量子点→NHS→加入阿萨尔吉亚芽孢杆菌菌液标记，标记率为24%，CdSe/ZnS 量子点加入偶联剂EDC 和NHS后标记阿萨尔基亚芽孢杆菌效率较不加入偶联剂时高，可能是菌液和偶联剂分散性好导致标记效率提高。

图7 核壳型量子点CdSe/ZnS表征

图8 CdSe/ZnS量子点标记阿萨尔吉亚芽孢杆菌

3 结论与讨论

本实验探究了水溶性量子点CdSe的合成方法及不同回流时间、不同温度、不同pH 值和不同Cd∶Se 配比等因素对其荧光强度和分散性的影响。探讨CdSe/ZnS［20-21］量子点经巯基丙酸（MPA）修饰后荧光强度和吸收峰的影响，并尝试用量子点标记阿萨尔基亚芽孢杆菌，进一步研究了偶联剂对量子点标记芽孢杆菌的标记效率的影响。

通过上述方法成功使用量子点对芽孢杆菌进行了标记，图8 标记结果可以看出，加入EDC 和NHS 偶联剂的样本标记效率比不加偶联剂的样本的标记效率要高。这可能是应为量子点经过巯基丙酸修饰后，在量子点表面引入了羧基，粘结剂（EDC）进而可以和羧基发生反应，形成中间体，稳定的中间体和阿萨尔基亚芽孢杆菌的表面上的氨基结合。复合型量子点CdSe/ZnS 按照菌液→量子点→EDC→NHS→PBS缓冲液依次加入，EDC并没有充分发挥作用生成中间体，而NHS 也作用甚微，这造成了量子点大面积的聚集，这样量子点就不能充分与菌体结合。CdSe/ZnS量子点按照EDC→量子点→NHS→菌液→PBS缓冲液的顺序加入，让量子点与EDC 充分结合之后再与细菌结合便能极大地提高量子点的标记效率［21-22］，本实验也证明了先加粘结剂后加菌悬液，可以提高量子点的标记率。

本文首先合成水溶性量子点，并用MPA 修饰，可用于标记有抗菌作用的阿萨尔基亚芽孢杆菌。合成CdSe 量子点以后，再进行巯基乙酸修饰，合成了CdSe/ZnS 核壳型量子点，并探究了两种量子点在EDC 和NHS 偶联剂作用下对阿萨尔基芽孢杆菌的标记效率。本文为建立生防菌阿萨尔吉亚芽孢杆菌的荧光探针标记提供新的思路。