流产性转录本及流产性起始的研究现状和进展

闫伟伟 秦少伟 赵利峰,2*

（1 塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔843300）

（2 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室—国家省部共建培育基地，新疆 阿拉尔843300）

流产性转录本（abortive transcript, AT）是一类特殊的非编码RNA，是指在基因转录的起始阶段由RNA 聚合酶重复合成并释放的许多短片段初生RNA，该现象被称为流产性起始［1-3］。自被发现以来，流产性起始的发生机制以及流产性转录本的生物学作用一直都是一个未解之谜。为此国内外科研人员也在不停地对它们进行着探索。近年来随着实验技术的发展，它们的神秘面纱也在被逐渐揭开。

1 流产性转录本和流产性起始的发现

1976 年Johnston 等在冷泉港实验室发现，RNA聚合酶的延伸反应在缺少两种NTP 的转录体系中被阻止，出乎意料的是，这些新生RNA 被快速释放出来。然而他们很快又有了新的发现：当四种NTP均存在的情况下RNA 聚合酶开始转录后仍然产生长度不等的流产性RNA，长度范围为2～8 nt［4］。1980 年，Carpousis 等再一次在体外实验中检测到了2～6 nt 长度不等的流产性RNA，并将其命名为流产性转录本（abortive transcript,AT）。同时发现在所有长度不等的流产性转录本中，2 nt 长的占比例最大，约占总量的50%［5］。后来其他研究者在体外转录实验中也得到了类似的研究结果，发现流产性转录本的长度一般在2～10 nt 之间，最长可达19 nt［6］。流产性起始的重复过程被称为流产性循环，通常要经过10～100 个循环以后，RNA 聚合酶才能从启动子上逃逸出来，开始正常转录。体外实验发现，流产性起始普遍发生在细菌、古菌、真核生物和噬菌体等基因转录起始阶段［6］。2009 年Goldman 等首次在大肠杆菌（Escherichia coli）体内证明了流产性起始现象的存在［7］。

2 流产性转录本和流产性起始的发生机制及影响因素

流产性转录本和流产性起始一经发现就立刻引起了世界各地科学家的兴趣。自它们被发现以来的40 余年时间里，流产性转录本与流产性起始的研究从未间断，科学家们对流产性转录本和流产性起始的发生机制研究也有了许多成果。

研究发现，流产性转录本的发生和RNA 聚合酶中σ 亚基的结构有关。σ 亚基中连接其2 个功能域（σ3 和σ4）之间的链环靠近RNA 聚合酶的活性位点，且位于全酶释放RNA 产物的通道内，可能具有阻止RNA产物延伸的作用。该链环与初生RNA之间对该通道的占据存在竞争作用，当链环赢得竞争时，初生RNA 则以流产性产物—流产性转录本的形式释放出来；当RNA 分子链成功延伸超过12 nt 时，新生成的RNA 链则可将该链环置换出来，这时流产性起始停止［8］。σ 亚基的1.2 区能够与转录起始位点-4 位发生作用，从而促进转录起始位点下游DNA 解旋，但该过程中σ 亚基1.2 区需要β 亚基lobe 区的协助，流产性起始发生的原因可能在一定程度上与σ 亚基1. 2区和β 亚基lobe 区不能正常打开下游DNA 双链有关［9］。另外，σ 亚基的3. 2 区在RNA 聚合酶中的位置、His-β1237的突变和β 亚基S531的突变均能改变流产性起始发生的水平［10-13］。

从流产性转录起始到全长RNA 合成的转换过程被称作启动子逃逸（promoter escape）［6］。流产性转录本产生的原因也与启动子逃逸的过程密切相关。流产性起始产生的蜷缩模型认为（见图1），由图可以看出：在转录的起始阶段，RNA 聚合酶固定在启动子上并不移动，而是将聚合酶下游的DNA 募集到聚合酶里来，DNA 在聚合酶里以单链泡形式堆积，在此过程中形成具有DNA 解旋应力和DNA 压缩应力的中间体，其中累积的应力用于破坏RNA 聚合酶与启动子DNA之间以及RNA聚合酶与起始因子之间的相互作用。当RNA 聚合酶与启动子DNA 以及起始因子的作用力被破坏后，RNA 聚合酶才从启动子上逃逸进入转录的延伸阶段［14］，并且在转录的起始阶段，当新合成的转录本达6 nt和7 nt时，RNA 聚合酶有一个短暂的停留，这导致7 nt 和6 nt 长的流产性转录本含量相对也较高［14,15］。研究发现，启动子序列与其保守序列越接近越不容易逃逸，所产生的流产性转录本就越多［16］。同时启动子序列还影响流产性转录本的长度，15 nt 流产性转录本就是在启动子突变的T5 噬菌体N25基因转录实验中发现的［6］。

图1 流产性起始的蜷缩模型

此外，流产性起始还受到起始转录序列、转录延伸因子GRE 等的影响。改变转录起始序列（如将A变成C，将G变成T）不影响转录起始阶段转录复合物的形成和总体起始转录的水平，但可以使全长mRNA的合成降低10～25 倍［17,18］。研究发现，转录延伸因子GRE 能降低流产性起始的发生。当新生转录本3′端的-OH 不与RNA 聚合酶的催化位点接触时，RNA 聚合酶停止转录。此时GRE能与停止转录的RNA聚合酶相互作用，诱导聚合酶对新生转录本的切割反应，重新激活RNA 聚合酶的转录活性［19,20］。通用转录因子TFIIB 则能促进流产性起始的发生，在真核生物和古菌基因的转录起始阶段，TFIIB 能通过促进RNA 聚合酶的招募，从而刺激流产性起始的发生［21］。

3 流产性转录本和流产性起始的生物学作用

众所周知，生物体对自身基因表达以及物质和能量代谢有着严格的调控机制。因此，流产性转录本和流产性起始绝非是生命体无意义的行为。虽然目前关于流产性转录本生物学作用和流产性起始的生物学意义知道的很少，但一些研究工作表明流产性转录本是具有生物学作用的。在它们被发现以来的40 多年里，研究人员对流产性转录本的生物学作用进行了深入探索，也取得了许多有意义的成果。

流产性转录本有可能以引物的形式参与RNA 和DNA 的合成。通常，所有细胞中转录起始都是利用单核苷酸作为起始逐一合成一条长链RNA。但是体外关于引物依赖的转录起始研究表明，无论是真核生物还是原核生物的RNA 聚合酶都能利用2～8 nt长度不等的寡聚核苷酸来引发转录的起始［22-30］。2011 年，Goldman 等发现在大肠杆菌体内的RNA 聚合酶利用2～4 nt人工合成的流产性转录本引发转录起始，同时发现能作为引物的流产性转录本在序列和长度上有着极其严苛的要求，只有长度在2 nt 到4 nt之间，序列与DNA 模板链互补，且5′端在-3到+1之间，3′端在+1 到+3 之间的流产性转录本才能够作为引物促进转录［31,32］。还有研究发现，原核生物T7 RNA 聚合酶通过合成引物启动DNA 的复制。φ1·1B 启动子的最短引物长度是8 nt，因此8 nt 的流产性转录本可作为DNA 复制的引物。早期DNA 复制系统似乎利用了DNA 依赖性RNA 聚合酶的流产性循环，这种循环在“DNA World”出现前就已存在，原始RNA 聚合酶的进化可以引发DNA 的复制。因此，流产性循环可能在“DNA World”的进化中发挥着重要作用［33］。

流产性转录本有转录抑制的作用。体外转录实验表明，流产性转录本的长度主要在2～10 nt，最长到19 nt，且主要集中在2 nt、4 nt、6 nt 和7 nt［7,14］。研究发现如果通过抑制短链核酸酶的作用来增加细胞内长度小于或等于4 nt短寡核苷酸的浓度，一些基因的表达水平增加，但另一些基因的表达水平则降低［31］。根据Goldman 等总结的规律，2 nt 和3 nt 的流产性转录本可以促进自身基因的转录，那么其余不能作为引物的短寡核苷酸则可能具有转录抑制作用，而大于或等于4 nt的流产性转录本并不符合上述作为引物的要求，所以也可能具有转录抑制作用。2016 年，Qin SW 等利用体外转录实验结合实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）技术，检测了3 个大肠杆菌基因meta（homoserine Osuccinyltransferase）、ompa（outer membrane porin A）和reca（recombinase A）的4 nt 和6 nt 流产性转录本对自身基因和其它基因转录的影响，发现流产性转录本对自身和其它基因的转录均具有抑制作用，且最大抑制率可达7.5 倍（图2），认为流产性转录本可能通过影响转录延伸复合物的稳定性从而影响转录的进行［34］。

流产性转录本可能还有其他的生物学作用。研究还发现，噬菌体T710φ 基因产生的流产性转录本富含G，恰好能与其终止子上两个5 nt和6 nt长、富含C 的延伸序列相互作用，阻止发夹结构的形成，从而抑制转录终止［35］。含有短RNA的转录复合物的X射线晶体结构揭示了三种结构状态：一种是具有2 nt和3 nt 的RNA，其中只有RNA 的3'末端是可检测的；第二种状态是具有4 nt 和5 nt 的RNA，此时RNA-DNA杂合体具有严重扭曲的构象；还有一种具有6 nt或更长RNA 的第三种状态，这种状态基本上与稳定的延伸复合物相同。从第一状态到第二状态的转变与显著降低的流产起始频率有关。从第二状态到第三状态的转变与部分“气泡坍塌”（bubble collapse）和促进启动子逃逸有关。学者推测在这个过程中流产性起始可能起着启动子控制的检验点（checkpoint）和校正点（calibration point）作用［36］。

图2 被不同流产性转录本干扰后基因表达水平的变化

4 展望和小结

尽管流产性转录本和流产性起始的发现至今已有40 余年，但依然存在许多未知的谜团。目前对于流产性起始发生机制的研究相对较多，但对于流产性转录本的生物学功能研究仍然处于起步阶段。制约流产性转录本研究的瓶颈主要是自然产生的流产性转录本长度一般不超过10 nt，用qRT-PCR 或常规探针方法无法对其进行定量检测。目前检测较短流产性转录本的方法有两种。其中一种是基于特定转录模板和P32标记NTP 的体外转录实验，这种方法只能在体外通过放射自显影技术检测流产性转录本的长度和含量，并不能对流产性转录本的序列进行鉴别，也无法对机体内自然产生的流产性转录本进行定性和定量分析。另一种则是利用锁核酸探针对流产性转录本进行检测。锁核酸（locked nucleic acid,LNA）是一种类寡核苷酸衍生物，其结构中的β-D-呋喃核糖的2'-O、4'-C 位通过缩水作用形成刚性的结构，该结构能降低单体中核糖结构的柔韧性，增强局部磷酸骨架稳定性。研究表明在探针的核酸序列中每增加一个锁核酸单体能够使寡核苷酸链的解链温度提高2～8℃，从而提高其与目标序列的结合能力，且比常规的寡核苷酸具有更高的专一性［37］。Goldman 等正是用锁核酸探针实现了对启动子突变的T5噬菌体N25 基因产生的11 nt长流产性转录本的直接检测［7］，该方法较第一种研究方法的优势是可以对特定序列的流产性转录本进行体外检测，但仍然无法对生物体内自然产生且10 nt以下的流产性转录本进行定量检测。目前，检测技术的发展进步很快，单分子检测、荧光原位杂交等新技术正越来越多地得到应用。如果能对机体内的流产性转录本实现定性和定量检测，则可以在机体内利用转基因技术人为干扰某一基因流产性转录本的含量，从而确定流产性转录本的生物学功能。同时，生物体内流产性转录本比全长转录本高几十倍甚至上百倍的含量还使其具有成为肿瘤或其他疾病标志物的潜在可能，在未来临床分子诊断和检测中有着潜在的应用价值，一旦在检测技术上取得突破，流产性转录本将可能成为一种新型生物标志物为人类健康做出巨大贡献。

总之，流产性起始的发生由RNA 聚合酶的结构和RNA 转录起始的模式所决定，是RNA 转录中必不可少的一种生物学现象，普遍发生在一切以RNA 聚合酶为特征的生物的每一次转录中。目前，对流产性转录发生的机制已基本了解，对其生物学作用知道的仍然不多，但其存在的广泛性暗示其可能有重要的生物学作用，最新的研究也表明流产性转录本在基因的转录过程中具有重要的调控作用。相信随着对体内10 nt 以下的寡核苷酸定量检测技术的发展，一定能有效解决目前流产性转录本的体内定量检测的问题，也终将对流产性转录本的生物学功能作出阐释。