山羊痘病毒059蛋白表达及鉴定

米丽开姆·托合提尼亚孜 张雪萍 何川川 童剑军杨 倩 李有文,2*

（1 塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔843300）

（2 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔843300）

（3 塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔843300）

羊痘是由羊痘病毒（Capripox virus, CPV）感染山羊、绵羊或牛等反刍动物引起的一种烈性传染病。病畜以发热、全身起痘为典型特征［1］。羊痘病毒包括山羊痘病毒（Goatpoxvirus, GTPV），绵羊痘病毒（Sheeppoxvirus, SPPV）和皮肤疙瘩病病毒（Lumpy skin disease virus,LSDV）三个种［1］。

一般来说，羊痘病毒对宿主的感染范围是非常局限的，即山羊痘病毒只感染山羊而绵羊痘病毒只感染绵羊，皮肤疙瘩病病毒只感染牛，但实际生产中也有交叉感染［2,3］，人也偶有感染的报道。羊痘病毒是在细胞浆内复制的有囊膜的双股DNA 病毒［4］。成熟的病毒粒子多呈卵圆形，大小约为150～180 nm×150～180 nm［5］。山羊痘病毒基因组呈线形，全长约150 kb，共编码147 个开放阅读框（ORF），编码密度为93%［6］。其中间区域（ORFs024～123）是羊痘病毒的保守序列，编码与病毒DNA 复制，转录，蛋白合成、加工等生长繁殖相关的重要蛋白［2］。核心蛋白就是中间区域中一类重要的结构蛋白［3］。对山羊痘病毒Pellor 株的全基因组研究发现其含有3 种6 个病毒核心蛋白［2,7,8］：包括1 个病毒核心蛋白（viral core protein）ORF091 基因，3 个DNA 结合的病毒核心蛋白（DNA-Binding core protein）ORF027、ORF039、ORF059 基因和2 个推测的核心蛋白（Putative core protein）ORF037、ORF053 基因［5］。核心蛋白是一种多功能蛋白，对丙肝病毒（HCV）研究发现其核心蛋白是病毒粒子核衣壳的组成成分，HCV 核心蛋白的表达可以引起肝脂肪变性和肝细胞癌（HCC）的发生［9］。另外，HCV 核心蛋白还可抑制宿主的免疫功能，干预细胞凋亡及正常生长过程等［10］。对于羊痘病毒核心蛋白的研究资料尚不多，但肯定会有重要作用，为了了解羊痘病毒核心蛋白ORF059 结构特点和生物学特点，本研究拟对2010年新疆南疆暴发的山羊痘疫情中的山羊痘病毒分离珠（GTPV-Thx-2010）的ORF059 基因进行扩增、序列分析，并进行原核表达,初步研究其生物学特性，为进一步对其生物学功能和作用机制等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株与菌种

本实验的毒株来自新疆南疆2010 年流行的羊痘分离株（THX 株），保存于塔里木畜牧科技重点实验室；原核表达系统用宿主大肠杆菌DH5α、BL21、原核表达载体pET-42 b 含His 标签均保存于新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室。

1.1.2 主要药品及试剂

2×Utaq PCR Mix（购买自北京庄盟国际生物基因科技有限公司），PrimeSTAR HS DNA Polymerase、dNTP、T4 DNA 连接酶（购自大连宝生物科技有限公司），琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒（购买北京天根生物工程技术服务有限公司），EcoRI、XhoI（购自Thermo 公司），DNA 纯化试剂盒（购自美国Omega公司）。Western blot 用DAB 显色剂（购买自武汉博士德生物工程有限公司），实验常用试剂配制方法见附录。

1.1.3 主要使用仪器

琼脂糖水平电泳仪（北京六一生物科技有限公司），F250 经济型加热制冷循环器（优莱博技术（北京）有限公司），ZWY-103B 恒温培养振荡器、ZXGPB2160 隔水式恒温培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司），全自动凝胶成像分析仪、HC 高电流电泳仪、T100 Thermal Cycler 梯度PCR 仪、Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽、Mini-Trans-Blot 电泳转印槽（Bio-Rad生命科学有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 山羊痘病毒基因组的提取

将被病毒感染过的细胞培养液取200 µL 到1.5 mL 的离心管中，按照天根生物科技有限公司的病毒基因组提取试剂盒说明提取山羊痘病毒基因组备用。

1.2.2 原核表达载体构建

1.2.2.1 引物合成

根据参考已经在GenBank 上发表的羊痘病毒基因的全序列（GenBank AF124517）中059 号基因的序列，用DNAMAN 软件设计059 号基因的特异性引物，为了便于后期克隆，分别在其上下游引物的5′端加NdeΙ、XhoΙ 限制性内切酶切位点（下划线处），引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成，见表1。

表1 合成的引物

1.2.2.2 059基因的扩增

以GTPV-THX-2010 株提取的基因组为模板，用059基因的特异性引物PCR 扩增。100µL扩增体系：模板4. 8 µL，5×PrimeStar Buffer 20 µL，dNTP4 µL，上下游引物各2. 4 µL，PrimeStar HS DNA Polymerase 1.2µL，dd H2O 65.2µL。扩增程序：94 ℃40 s、94 ℃30 s、57 ℃40 s、72 ℃40 s，72 ℃10 min，30 个循环。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后纯化回收（按照DNA回收试剂盒操作）。

1.2.2.3 059基因与质粒的酶切与纯化

取059 基因20 µl，pET-42b 质粒15 µl 分别于两个离心管，分别加通用10xBuffer 4 µl，EcoRI 2 µl，XhoI 2µl，加入水至40µl，充分混匀后，于37 ℃水浴锅中3 h。酶切产物用DNA纯化试剂盒纯化，保存备用。

1.2.2.4 059基因与原核表达载体的连接与鉴定

将酶切纯化的059 基因5 µl 与载体1 µl 于同一离心管中，加T4 连接酶1 µl，10xT4buffer 1 µl，水2 µl，于16 ℃水浴连接8～10 h。将连接产物转化入大肠杆菌感受态DH5α 并涂板培养12 h，挑菌摇菌，做菌液PCR 鉴定，PCR 阳性菌提取质粒，并做双酶切（EcoRI/XhoI）鉴定，质粒送武汉天一辉远生物有限公司测序鉴定。

1.2.3 THX 株059基因核苷酸及推测的氨基酸序列分析059 基因的测序结果利用软件DNAMAN 和DNASTAR 进行同源性比较和遗传进化关系分析。并推测其氨基酸序列，做蛋白质二级结构分析和分子量预测。

1.2.4 059蛋白表达及鉴定

1.2.4.1 059蛋白的表达取经鉴定构建正确的质粒转化大肠杆菌感受态BL21，按张孝忠等［11］的方法表达并鉴定其结果。

1.2.4.2 Western Blot检测

对059 基因的表达产物进行SDS-PAGE 电泳。按张孝忠等［11］的方法表达并鉴定其结果。

2 结果

2.1 PCR扩增目的基因

目的基因通过PCR 扩增之后，其产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定得到GTPV-059 号基因全长结果，765bp处有一条带，与理论值相符，见图1。

图1 GTPV-059基因PCR扩增

2. 2 PET42b-GTPV-059 重组质粒的菌液PCR 检验结果

按照分子克隆的常规方法，将pET42b 载体和PCR产物连接，转化后挑单菌落摇菌并进行菌液PCR 鉴定，得到PET42b-GTPV-059的阳性质粒结果见图2。

图2 PET42b-GTPV-059重组质粒菌液PCR鉴定

2.3 PET42b-GTPV-059重组质粒双酶切结果

双酶切鉴定重组质粒PET42b-GTPV-059的鉴定结果见图3。

图3 PET42b-GTPV-059重组质粒双酶切鉴定

2.4 GTPV-059基因序列分析

表2 GTPV-059基因核苷酸及氨基酸序列

THX 株059 基因的测序结果如表2 右侧所示，该基因全长约765 bp，与参考株GTPV-Pellor 相似性高达99.34%，序列分析显示该基因C+G 含量为26.12%，与羊痘病毒整体GC 组成一致；推测编码255 个氨基酸（如表2 左侧），其中强酸性氨基酸（D,E）35 个，强碱性氨基酸（K,R）32 个，等电点为5.4，分子量为29 KDa，阴影区为强碱性区域。

2.5 GTPV-059遗传进化树

根据GTPV-059 的测序结果，与GenBank 中发表的羊痘的序列做遗传进化分析，本次分离的山羊痘病毒南疆株与其他山羊痘病毒株聚于一个分支，亲缘关系最近。对059 基因，羊痘病毒属的三处种中，绵羊病病毒与疙瘩皮肤病病毒的亲缘关系相对较近，而与山羊痘病毒的关系较远（见图4）。

图4 GTPV-059基因遗传进化关系分析

2.6 GTPV-059蛋白二级结构分析

对推测的GTPV-059 蛋白的氨基酸序列进行分析，预测其蛋白二级结构以α 螺旋为主，多个α 螺旋与β 折叠结构交织，并有较多的转角相连，蛋白有较强的亲水性和抗原性，见图5。

图5 GTPV-059蛋白二级结构分析

2.7 059蛋白表达检测

本实验通过SDS-PAGE 电泳对原核表达中的蛋白进行检测，发现GTPV-059 蛋白大小29 KDa，与理论一致，蛋白表达量较高，见图6。

图6 059蛋白原核表达检测

2.8 059蛋白Wastern-blot鉴定

用His 一抗鉴定059 蛋白与His 标签融合表达的结果见图7。

图7 059蛋白表达的Wastern-blot鉴定

3 讨论

核心蛋白是一类与糖胺聚糖共价结合的多肽链的总称，也是一类具有重要生物功能的蛋白质，所有生物均含有核心蛋白，包括动植物和细菌病毒等微生物［12］。目前发现的核心蛋白约2 万～25 万种。羊痘病毒就含有至少6种核心蛋白，这可能与痘病毒特殊而复杂的增殖过程相一致。痘病毒是一类有囊膜的不分节段的大型双股DNA 病毒，与许多dsDNA 病毒在宿主在细胞核中复制不同的是痘病毒有自己在宿主细胞质中复制的特殊复制机制，病毒增殖过程中的很多酶、调节蛋白都是由病毒自身的蛋白完成，病毒转录只识别痘病毒科的启动子，病毒基因表达分两个阶段，早期基因编码非结构性蛋白质参与基因组复制，晚期基因编码病毒结构蛋白［13］。在此过程中，核心蛋白可能发挥重要作用。目前研究发现乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（HBc）作为pregenomic启动子的转录激活剂［14］。

在本研究中，克隆了新疆南疆2010 年暴发的羊痘病毒疫情中的分离株THX株的ORF059基因，并构建了原核表达载体PET42b-GTPV-059，用IPTG 诱导表达了其蛋白，并分析预测了其二级结构。发现该蛋白是以α-螺旋为主，β-折叠或片层结为辅，并由少量的转角连接，交替形成的蛋白的二级结构（见图5）。作为一个核蛋白，其应该是一个带阳离子的碱性蛋白，但是该蛋白等电点为5.4，是一个酸性蛋白。分析该蛋白氨基酸组成发现其中间区域有一个强碱性区域（见表2-AA 序列中阴影），对应区域也是强的亲水性区域（见图5 第8 行122-127 区域），这可能是一个与核苷酸结合的位点。另外DNA 结合蛋白质可能包含锌指，helix-turn-helix，亮氨酸拉链等结构，促进核酸绑定。图5 所示有二级结构中可见有多个helix-turn-helix 的结构，也可以作为核蛋白的可能性的证据。作为核心蛋白都含有几个不同的结构域，分析ORF059 蛋白中包含至少3 个结构域，符合核心蛋白的结构条件。

本研究的ORF059 蛋白就是山羊痘病毒核心蛋白之一。该蛋白有255个氨基酸构成，在细菌中可以较好的表达，得到大量蛋白，有利于其高级结构和生物学功能的研究。该蛋白是一种DNA 结合核心蛋白，因此既是一种核心蛋白，也是一种核蛋白（nucleoprotein）。核蛋白就是与核酸结合的蛋白质，因其最初发现于细胞核中而得名，其实在细胞核及细胞质中都含有。核蛋自在生物的生长和繁殖过程中有着独特的功能和作用。如包裹基因组防止其被降解，参与基因的复制、转录等的调节。核蛋白一般都含有特殊的氨基酸信号序列,起蛋白质定向、定位作用.如烟草斑纹病毒与小儿麻痹症病毒、流行性感冒病毒等动植物病毒本身就是核蛋白［15］，所以核蛋白的研究在动及植物病害的防治及临床医学上有十分重要意义。