短期低压低氧对小鼠肠道黏膜免疫功能的影响*

寇 娜，周义玲，纪巧荣，张 昱，刘 杰，高 翔，袁周阳，张 伟

(青海大学医学院；青海省高原医学应用基础重点实验室，青海 西宁810001)

国际上将海拔2 500米以上的地区定义为高原[1]。高原环境作为一个特殊的生态系统，具有低压、低氧特点。其是否会对机体的消化系统及免疫功能产生影响，本研究通过观测低氧7、14 d小鼠体重，血常规和结肠组织形态学的变化，以及肠系膜淋巴结T淋巴细胞培养上清中细胞因子、血清中免疫球蛋白含量的变化，探讨短期低压低氧对小鼠肠道免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级BALB/c雌性6周龄小鼠，体重(26±2)g。购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2012-0001，NO：11400700176022]。

以无菌水和消毒食物饲养(IVC)4周后，每组选用10只进行实验。动物的使用和处理经过青海大学医学院实验动物伦理委员会批准。

1.2 实验试剂及仪器

抗小鼠CD3抗体(Anti-CD3)、抗小鼠1stAb、标准品和抗小鼠2ndAb(IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-17、TNF-α及IgG1)均购自美国BD公司；辣根过氧化物酶、浓硫酸、TMB显色液及吐温-20购自上海玉博生物科技有限公司。HE染料购自珠海贝索生物技术有限公司；TB染料购自南京建成生物工程研究所。实验动物低压模拟舱(HCP ⅢD 800)购自西安富康空气净化设备工程有限公司，酶联免疫检测仪(infinite M200 PRO)购自帝肯上海贸易有限公司，冰冻切片机(LEICA CM1950)、石蜡切片机(LEICA RM2235)均购自德国莱卡仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 低氧动物模型构建

实验小鼠随机分为常氧对照组、低氧7 d组及低氧14 d组，每组小鼠10只。其中，低氧7 d组和低氧14 d组分别在模拟海拔5 000 m低压氧舱连续饲养7、14 d后取材，常氧对照组常规饲养14 d取材。

1.3.2 相关指标检测

(1)连续观察各组小鼠体重的变化；(2)检测3组小鼠的红细胞压积；(3)检测血清特异性抗体[心脏采血，放置2h后离心(5000r/min)10 min，分离取得血清。以ELISA法检测特异性抗体IgG1的含量]；(4)检测淋巴细胞因子[取材前一天用48孔板包被CD3抗体(100μL/孔、5μg/mL)，4 ℃避光过夜。取材当天处死小鼠、消毒，开腹取出肠系膜淋巴结。研磨肠系膜淋巴结组织，用70 μm尼龙细胞过滤网过滤制备淋巴细胞悬液。取出细胞(5×106)溶于1 mL cDMEM溶液中。包被好的48孔板用PBS漂洗一次，加入细胞(5×106)，置于37 ℃培养箱(5% CO2)，72 h后抽取培养液上清置-20 ℃冰箱冻存。以ELISA法检测Th1细胞因子IFN-γ、Th2细胞因子IL-4、Th17细胞因子IL-17、Treg细胞与Th2细胞均可分泌的细胞因子IL-10以及TNF-α的含量；(5)将结肠组织HE染色[取出结肠约0.5 cm，用OCT包埋，过液氮，冻存于-60 ℃冰箱。连续冰冻切片(5μm)后HE染色]；(6)将小肠组织肥大细胞行TB染色[取出十二指肠中段约0.5cm，浸泡于4%多聚甲醛中，存于4℃冰箱。切片(4μm)后行TB染色]。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 短期低压低氧对小鼠体重的影响

各组小鼠体重如下表，实验7 d后，低氧组小鼠体重低于常氧对照组(P<0.05)；实验14 d后，低氧组小鼠体重显著低于常氧对照组(P<0.05)(表1)，提示短期低压低氧会使小鼠体重明显降低。

Table 1Effect of short-term hypobaric hypoxia on body weight of

2.2 短期低压低氧对小鼠红细胞压积的影响

与常氧对照组相比，低氧7 d组小鼠红细胞压积无显著性变化，低氧14 d组红细胞压积略有升高(表2)，提示短期低压低氧刺激会使小鼠红细胞增多，红细胞压积升高。

Table 2Effect of short-term hypobaric hypoxia on hematocrit in

*：与低氧7 d组相比，P<0.05；#：与常氧对照组相比，P<0.05

2.3 短期低压低氧对小鼠血清IgG水平的影响

与常氧对照组相比，低氧7 d组与低氧14 d组小鼠血清中IgG1含量均无明显变化；低氧7 d组与低氧14 d组相比，小鼠血清中IgG1含量无明显变化(表3)，提示短期低压低氧对血清中IgG的水平不产生影响。

Table 3Effect of short-term hypobaric hypoxia on serum IgG1 levels in

2.4 短期低压低氧对肠系膜淋巴结T淋巴细胞分泌细胞因子的影响

与常氧对照组相比，低氧7 d组小鼠T淋巴细胞分泌的IL-4、IL-10、IL-17及IFN-γ的含量无明显变化，TNF-α含量明显升高(P<0.05)；低氧14 d组小鼠T淋巴细胞分泌的IL-4含量无明显变化，IL-10及TNF-α含量明显升高(P<0.05)，IL-17及IFN-γ含量明显降低(P<0.05)；低氧14 d组与低氧7 d组相比，IL-4及TNF-α含量无明显变化，IL-10含量明显升高(P<0.05)，IL-17及IFN-γ含量明显降低(P<0.05，表4)，提示短期低压低氧会对小鼠肠系膜淋巴结T淋巴细胞分泌细胞因子产生影响。

Table 4Effect of short-term hypobaric hypoxia on cytokine secretion by T lymphocytesin mouse mesenteric lymph

*：与低氧7 d组相比，P<0.05；#：与常氧对照组相比，P<0.05

2.5 小鼠结肠组织HE染色结果

HE染色结果提示，常氧对照组小鼠结肠组织未见任何病理变化；低氧7 d组结肠无明显病理变化；低氧14 d组结肠黏膜上皮出现轻微破损、黏膜固有层出现轻微水肿情况(图1)。

A：正常对照组，B：低氧7 d组，C：低氧14 d组

图1小鼠结肠组织HE染色(10×)

Figure1HE staining of Mouse colon(10×)

2.6 小鼠小肠组织肥大细胞甲苯胺蓝染色结果

甲苯胺蓝染色结果提示，常氧对照组小鼠小肠组织肥大细胞数量较少，未见明显聚集现象且肥大细胞主要呈未脱颗粒状态；低氧7 d组小鼠小肠可见散在肥大细胞，部分呈脱颗粒状态；低氧14 d组小鼠小肠组织肥大细胞主要呈脱颗粒状态(图2)。

A：正常对照组，B：低氧7d组，C：低氧14d组

图2小鼠小肠组织甲苯胺蓝染色图(40×)

Figure2TB staining of Mouse small intestine(40×)

3 讨论

本实验结果显示，低氧14 d组小鼠红细胞压积明显升高。有研究指出间歇性低氧训练会使大鼠红细胞压积在1周训练结束时略微上升，在第2周上升到较高水平[2]。

IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，主要由脾脏和淋巴细胞中的浆细胞合成，是机体重要的抗病毒、抗菌和抗毒素抗体。有研究指出，体液免疫以IgG产生为指标[3]。本实验中，3组小鼠血清中IgG含量无明显差异，提示短期低压低氧刺激对B淋巴细胞分泌抗体功能影响不明显。一些研究认为，低氧对IgG水平不产生显著性影响[4-6]。而有的研究则认为低氧可引起IgG水平升高或降低，并且参与到高原低氧的应激反应中[7]。

本实验结果显示，低氧7 d组与常氧对照组相比，T淋巴细胞分泌的相关细胞因子无明显改变，仅TNF-α的含量略有升高。有研究表明高原低氧环境中TNF-α水平明显升高，可能参与了机体急慢性低氧的应激反应过程[8]。低氧14 d组与常氧对照组相比，TNF-α及IL-10含量明显升高，IL-17含量明显降低，IL-4和IFN-γ含量无明显变化。有研究认为，通过缺氧条件刺激，CD4+T淋巴细胞分泌的经典促炎因子IL-17和IFN-γ产生减少，抑炎因子IL-10产生增多[9]。低氧14 d组与低氧7 d组相比，IL-10、IL-17、IFN-γ及IL-4含量发生了明显变化，而TNF-α含量无明显变化，正常情况下，机体Th1细胞/Th2细胞、Th17细胞/Treg细胞处于一种动态平衡。有研究认为，低氧刺激主要影响CD4+Th1细胞的功能，高原低氧暴露可能导致Th1细胞/Th2细胞免疫应答平衡调节紊乱[10]。本实验结果提示短期低压低氧刺激会改变小鼠肠系膜淋巴结T淋巴细胞的免疫功能，使其Th1细胞/Th2细胞、Th17细胞/Treg细胞亚群的平衡紊乱。

肥大细胞是一种具有强嗜碱性颗粒的细胞，主要分布在呼吸道、消化道黏膜和结缔组织中[11]，脱颗粒是肥大细胞的一种功能状态，炎症性肠病、胰腺炎、食物过敏及全身性肥大细胞增多症的发病过程中均可见脱颗粒，而且肥大细胞脱颗粒还可调节正常情况下和炎症性肠炎中肠道氯离子的转运，也可引起肠道蠕动紊乱。本实验中短期低压低氧刺激后，TB染色显示小肠组织有肥大细胞脱颗粒的现象，说明低压低氧刺激会激活肥大细胞。

综上所述，短期低压低氧刺激会改变小鼠肠系膜淋巴结T淋巴细胞的免疫功能，使Th1细胞/Th2细胞、Th17细胞/Treg细胞亚群的平衡紊乱，而对B淋巴细胞参与的体液免疫影响不明显。同时还会激活分布于肠道黏膜的肥大细胞，使其发挥相应的免疫功能。