内源性禽白血病病毒的RT-PCR检测与基因序列分析

陈 广， 温贵兰∗， 张喜懿， 程振涛， 王开功，文 明， 周碧君， 张升波， 田 浪， 杨佰启， 李昌红， 徐 丽

(1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物生物制品工程技术研究中心，贵州 贵阳 550016)

禽白血病(AL)是反转录病毒科，α反转录病毒属的禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起的禽肿瘤性疾病的总称，包括淋巴细胞性白血病、成红细胞增多症、成髓细胞性白血病、髓细胞瘤病、血管瘤、肾瘤和肾胚细胞瘤、纤维肉瘤和其他结缔组织瘤、骨硬化病以及其他类型的肿瘤[1]。目前ALV可分为ALV-A～ALV-K共11个亚型[2]。以禽为宿主的有 7 个亚型，即 A、B、C、D、E、J、K 亚型，其中致病性最强的为J亚型，自ALV-J被发现以来对世界养禽业造成了巨大的经济损失[3]，是目前世界上ALV造成经济损失最大的亚型。A、B、K 3种亚型致病性较J亚型弱，但仍有较强致病性。C、D亚型报道较少，E亚型为非致病性或者致病性很弱的ALV亚型[4]。现对贵州省凯里市某养鸡场送检病料进行ALV检测与基因序列分析的情况报道如下，与同行探讨。

1 材料与方法

1.1 检测病料贵州省凯里市某养鸡场4只送检病死蛋鸡的心、肝、脾、肺、脑组织。

1.2 主要试剂(1)RNA提取试剂盒，购自世纪元亨公司。(2)2×EsTaqDNA聚合酶，购自康为世纪有限公司。(3)反转录试剂盒、DL 2 000 DNA Marker，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物设计P27蛋白是禽白血病毒核心衣壳蛋白的主要成分，内、外源性ALV均含有p27基因，参照文献[5]根据p27基因设计1对ALV通用引物，引物序列为p27-EcoR I-F:CGGAATTCATGCCTGTAGTGATTAAGACAG；p27-XbaI-R:GCTCTAGACCTAGGGCTGGATAGCAGAC，预期扩增片段744 bp。

A、B、J亚型共用上游引物ALV-A/B/J:5’-CGG AGAAGACACCCTTGCT-3’；ALV-AR:5’-GCATTGC CACAGCGGTACTG-3’，预扩增片段 715 bp。ALVBR:5’-GTAGACACCAGCCGGACTATC-3’，预扩增片段 515 bp。 ALV-JR:5’-CGAACCAAAGGTAACA CACG-3’，预扩增片段 422 bp。

1.4 RNA提取与反转录参照RNA提取试剂盒说明书，无菌环境下提取病料组织中病毒总RNA，提取完成后于-20℃保存备用。以提取的总RNA为模板进行反转录，反转录体系:Primer Mix 2 μL、dNTP Mix 4 μL、DTT 2 μL、5×RT Buffer 4 μL、HiFiS-cript 1 μL、RNase-Free Water 5 μL、RNA 2 μL，42 ℃孵育 40 min，85℃ 孵育 5 min。反应结束后，2 500 r/min，离心10 s，置于 -20℃保存备用。

1.5 RT-PCR 反应反应体系:ddH2O 6 μL，2×TaqMasterMix 10 μL，cDNA 2.0 μL，上游引物 1.0 μL，下游引物1.0 μL，共计20.0 μL。 反应条件:95 ℃预变性5 min；95 ℃变性 1 min，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，共进行 35个循环；最后72℃再延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 测序与分析对目的条带割胶后，送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。在GenBank下载14株鸡源性ALV各亚型毒株各2株(见表1)。用生物学软件Megalign对所得序列与GenBank收录的14株ALV毒株进行同源性分析，并构建系统进化树。

表1 ALV参考毒株信息

2 结果与分析

图1 病料RT-PCR扩增结果

2.1 RT-PCR扩增结果按照RT-PCR反应体系和条件，PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，ALV通用引物在744 bp处出现特异性条带，而ALV-A/B/J 3个亚型引物检测为阴性，见图1。

2.2 同源性分析用生物学软件Megalign对该序列与GenBank收录的14株ALV毒株进行同源性分析，结果见图2。其中同源性最高的为ALV-E中的ev-1株和ev-3株，为99.5%(命名为:ALV-P27)。序列与J亚型代表毒株HPRS-103株的同源性较低，为36.2%。同源性最低是A亚型中的Schmidt-Ruppin A 株，为34.2%。 与 B、C、D、K 4个亚型间的同源性均在35.5%～37.1%之间，同源性都较低。

图2 ALV毒株同源性分析结果

2.3 系统进化树分析根据GenBank发布的序列，下载其中14株ALV毒株与序列构建系统进化树，结果见图3。所测基因序列与E亚型的ev-1和ev-3毒株亲缘关系较近，处在相同的1个分支。其与所有外源性ALV亲缘关系较远，处在关系最远的2个大的分支。

图3 ALV毒株遗传进化树分析

3 结论与讨论

3.1通过RT-PCR检测和基因序列比对，确定检测病料中存在ALV-E亚型感染，表明贵州家禽存在内源性ALV感染。

3.2禽白血病以引发肿瘤和免疫抑制为特征，分为内源性和外源性两大类[6]。内源性ALV指整合到宿主细胞染色体基因组中的可通过染色体垂直传播的ALV前病毒DNA及其可能产生的ALV粒子。内源性ALV一般不致病，但能与外源性ALV发生重组成为致病性更强的ALV[7]。内源性ALV的存在给养禽业带来了安全隐患，也干扰了对ALV的诊断。内源性ALV就像原癌基因，当原癌基因被激活时就引发癌症[8]。内源性ALV对鸡来说不是必须的，能否通过某些技术(基因编辑)培育出无内源性ALV基因的鸡品种还需进一步验证。