慢性镉暴露对背角无齿蚌肝脏的氧化损伤效应

贾嘉宝，井维鑫，李涌泉，王兰，刘娜

山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006

镉（cadmium，Cd）是一种工业上广泛应用、具有极强毒性的蓄积性环境污染物，被认为是水生态系统中对生物毒性最强的一种重金属[1]，可通过冶炼、合金制造、电镀、印染等生产活动排放到环境中，通过食物链传递进入人体。近年来，我国水体镉污染事件频发，对生态环境和人体健康造成严重威胁，引起社会各界对镉毒性的广泛关注。

镉可通过多种途径进入生物体细胞，直接或间接参加生物体内的生化反应，产生不可逆转的生物损伤[2]。已有研究显示，镉可在鱼类、虾、蟹等水生动物体内富集[3-4]，引起肝脏[5]、免疫系统[6]、生殖系统[7]等损伤。刘建博等[8]发现不同浓度镉暴露5 d 可引起文蛤（Meretrix meretrix）肝胰腺超微结构损伤；李艳东等[9]研究表明，中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）暴露于 Cd2+96 h 后其肝胰腺中胃蛋白酶、类胰蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性均受到不同程度的抑制。但这些研究大多采用急性暴露方式，暴露时间较短，不能全面反映镉的毒性效应及作用机制。在实际环境中，水生动物通常长期暴露于污染水体，所以研究镉对水生动物的慢性毒性效应具有更重要的现实意义。

背角无齿蚌（Anodonta woodiana）俗称河蚌，是我国常见的淡水经济贝类，分布广泛，埋栖生活在淡水湖泊、河流等底泥中，具有很强的污染物生物富集能力，对水环境中发生的物理、化学和生物性的各种变化反应非常敏感，是较理想的水污染指示生物[10]。我们通过在实验室条件下，分析不同浓度Cd2+暴露4 周以及暴露结束后继续用清水饲养4 周期间，背角无齿蚌肝脏中抗氧化酶活力及脂质过氧化水平，探究慢性镉暴露对背角无齿蚌的氧化损伤效应及作用机制，为水环境镉污染的生物监测与风险评估提供基础数据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

背角无齿蚌（壳长8.5±1.5 cm，宽4.8±1.3 cm，高3.2±1.2 cm）购自太原市五龙口水产市场，在实验室条件下（室温16～20℃，相对湿度50%～60%）驯养3 周，每48 h 换水1 次，养殖用水为曝气48 h的自来水，每次换水后投喂商品饲料。

氯化镉（CdCl2·2.5H2O）购自天津风船化学试剂科技有限公司；镉标准液（色谱纯）购自北京百灵威科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、过氧化氢酶（CAT）活力检测试剂盒，丙二醛（MDA）含量检测试剂盒和蛋白质浓度（Bradford 法）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 Cd2+暴露

根据背角无齿蚌96 h 镉半数致死剂量（134.9 mg/L）[11]设置 1 个对照组和 2 个处理组（Cd2+浓度为 0.1 和 0.5 mg/L），每组设置 3 个平行。随机选取144 只身体健康、大小相近的背角无齿蚌置于 9 个水族箱（50 cm×40 cm×30 cm）中，每箱16 只，暴露水体为5 L，对照组为曝气的自来水，处理组为不同浓度的Cd2+溶液。实验包括2 个阶段，共持续8 周：第一阶段为镉暴露期，用不同浓度Cd2+暴露背角无齿蚌4 周，每48 h 换水1 次；第二阶段为镉清除期，即将Cd2+暴露4 周后的背角无齿蚌再用清水饲养4 周，每48 h 换水1 次。实验期间养殖条件与暂养期间完全一致。

1.3 水体中Cd2+浓度测定

镉暴露期间对水体中Cd2+浓度进行测定，水样采集时间为每次换水后（0 h）、24 h 和48 h，采样点如图1所示，取5 个采样点的平均值作为当天的水体Cd2+浓度值，暴露期间共收集3 次水样。参考杨晓婧等[12]方法，采用火焰原子吸收光谱法测定水体中Cd2+浓度。

1.4 组织样品制备与生化指标分析

分别在镉暴露期和镉清除期的不同时间点从每个水族箱随机取2 只背角无齿蚌，剖取肝脏组织，吸干表面水分，称重，用液氮速冻后-80℃保存备用。实验时按1∶4的质量体积比在组织中加入预冷的生理盐水（0.86%），制成20%的组织匀浆液，4000 r/min 离心10 min，取上清液用于生化指标分析。用检测试剂盒测定SOD、CAT 和GPx 活力，MDA 含量和蛋白质浓度。结果以与对照组数值的百分比表示。

图1 水样采集示意图

1.5 统计分析

利用SPSS18.0 统计分析软件进行单因素方差分析，实验结果以3 个平行组数据的平均值±标准误（mean±SEM）表示，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 暴露水体中Cd2+含量

如表1和图2所示，换水后 0 h 水体中 Cd2+含量与设置的浓度值相近，换水后24 h 时各处理组水体中Cd2+含量有所下降，0.5 mg/L 组Cd2+浓度极显著低于 0 h 值，48 h 时 0.1 和 0.5 mg/L 组 Cd2+浓度均极显著低于0 h 值。

2.2 镉暴露对SOD活力的影响

由图3可知，0.1 mg/L Cd2+暴露并未对背角无齿蚌肝脏SOD 活力产生显著影响，但0.5 mg/L组SOD 活力随着暴露时间的延长而逐渐降低，即使在清除阶段仍极显著低于对照组水平（P＜0.01）。

2.3 镉暴露对GPx活力的影响

低浓度Cd2+暴露3 周时诱导了背角无齿蚌肝脏GPx 活力显著升高（P＜0.01），而在其他时间点无明显影响（图4），0.5 mg/L 组GPx 活力随着暴露时间的延长而呈先升高后降低的变化趋势，但均显著高于对照组（除第1 周外），清除第2 周时GPx活力恢复至对照组水平。

表1 暴露阶段饲养水体中的Cd2+含量（mg/L）

图2 暴露阶段饲养水体中Cd2+含量变化（n=3）

2.4 镉暴露对CAT活力的影响

如图5所示，除暴露第1 周CAT 活力显著下降外（P＜0.05），其余时间点低浓度 Cd2+组CAT 活力较对照组无明显变化。0.5 mg/L 组在暴露初期CAT 活力无显著变化，第4 周时CAT 活力被极显著抑制（P＜0.01），而且在清除阶段仍极显著低于对照组水平（P＜0.01）。

图3 镉对背角无齿蚌肝脏SOD活力的影响（n=6）

图4 镉对背角无齿蚌肝脏GPx活力的影响（n=6）

图5 镉对背角无齿蚌肝脏CAT活力的影响（n=6）

2.5 镉暴露对MDA含量的影响

低浓度和高浓度Cd2+暴露均可诱导背角无齿蚌肝脏MDA 含量显著升高（P＜0.05），并随着暴露时间的延长MDA 含量呈时间依赖性上升趋势（图6）。清除阶段各浓度组MDA 含量仍极显著高于对照组水平（P＜0.01）。

图6 镉对背角无齿蚌肝脏MDA含量的影响（n=6）

3 讨论

镉能通过Ca2+通道透过细胞膜而进入机体，诱导产生大量的活性氧（ROS）和自由基。这些活性物质与体内的生物大分子如蛋白质、脂质和核酸等反应，引起蛋白质羰基化、脂质过氧化、DNA断裂等损伤，对生物体造成氧化胁迫甚至导致机体功能障碍[13]。正常情况下，机体的抗氧化系统可以维持体内ROS的动态平衡，但当外界胁迫等因素引起ROS 过量而无法被清除时，就会造成机体的氧化损伤。SOD、GPx 和CAT 是抗氧化系统中重要的抗氧化酶，在机体防御氧化损伤中发挥重要作用。SOD 作为抗氧化防御系统的第一道防线，可将超氧阴离子自由基转化为H2O2和其他氢过氧化物[14]。在真核生物的细胞质和线粒体中存在 2 种 SOD，即 Cu/Zn-SOD 和 Mn-SOD，Cd 作为Zn的同族元素，其离子结构与Zn2+和Mn2+相似，所以 SOD 中的 Zn2+或 Mn2+能够被 Cd2+置换[15]，而被置换了金属离子的SOD 分子构象发生改变，导致其活力下降甚至丧失。本研究显示，0.5 mg/L Cd2+可以显著抑制背角无齿蚌肝脏SOD 活力，而且随着暴露时间的延长机体蓄积了大量Cd2+，它们置换了SOD的金属离子从而影响其分子构象，导致SOD 活力下降甚至丧失。镉清除阶段，虽然没有更多的Cd2+进入体内，但暴露期间进入机体的Cd2+已造成SOD 分子改变和功能损伤，所以即使清水处理也不能使SOD 活力恢复至正常水平。

由SOD 歧化生成的H2O2是一种强氧化剂，可以引起DNA 损伤和基因突变，还与肿瘤的发生有关[16]。抗氧化酶CAT 可以催化H2O2分解为H2O 和O2从而起到解毒作用[17]。邢慧芳等[18]报道，不同浓度Cd2+暴露96 h 时，背角无齿蚌外套膜过氧化氢酶活力随Cd2+浓度升高而呈现“抑制-诱导-抑制”的规律性变化，鳃中CAT 活力则呈逐渐升高的趋势，表明相同暴露条件下背角无齿蚌CAT 活力存在组织差异性。蔡垚[19]的研究显示，低浓度Cd2+暴露3 d 可显著诱导背角无齿蚌肝脏CAT 活力，而高浓度Cd2+暴露则明显抑制CAT 活力。上述研究均为急性暴露，CAT 活力的波动可能是背角无齿蚌对Cd2+胁迫的氧化应激反应。本研究中，0.1 mg/L Cd2+暴露第1 周即明显抑制了背角无齿蚌肝脏CAT 活力，与前期研究结果一致[18-19]，表明机体对Cd2+胁迫做出了应激反应，但随着暴露时间的延长CAT 活力恢复至正常水平。0.5 mg/L Cd2+暴露第4 周时显著抑制CAT 活力，直至清除结束CAT 活力仍处于较低水平。由此推测，低浓度Cd2+暴露可能在短期内会引起机体的氧化应激反应，表现为酶活力的变化，而随着暴露时间的延长，机体抗氧化防御系统的其他因子如GPx 也可能被调动发挥功能从而缓解了Cd2+对CAT 活力的影响。但当高浓度Cd2+长期暴露时，大量的Cd2+可能对CAT的合成及分子结构产生不可逆的影响，所以导致CAT 活力被显著抑制。

GPx 是一种含硒的抗氧化酶，也具有清除H2O2和氢过氧化物的功能[20]。本实验结果显示，0.1 mg/L Cd2+暴露并未对GPx 活力产生显著影响，但当0.5 mg/L Cd2+暴露2 周时背角无齿蚌肝脏GPx 活力被显著诱导，且随着暴露时间的延长GPx 活力一直处于较高水平。由此推测，在Cd2+暴露后期CAT 活力被显著抑制时，机体可能主要通过GPx 清除H2O2。但是，长期暴露导致背角无齿蚌体内蓄积了大量的Cd2+，机体产生的ROS 急剧增加，SOD 活力被抑制，抗氧化系统的防御功能受损，同时过量的Cd2+还可能不同程度地影响了抗氧化酶的合成及分子结构，导致酶含量和活力均下降，所以造成机体的氧化损伤，例如本研究中脂质过氧化物MDA 含量随着暴露时间的延长急剧升高。这与邓思平等[21]的研究结果一致。脂质过氧化为多不饱和脂肪酸或脂质在活性氧攻击下的氧化变质，将直接干扰和破坏膜的生物功能，最终影响机体的生理机能[22]。

综上所述，慢性Cd2+暴露可以通过抑制SOD活力、激活GPx 活力而影响抗氧化防御系统功能，长期、过量的Cd2+蓄积破坏了机体正常的氧化还原平衡，引起氧化损伤。然而，镉的慢性毒性作用机制与急性毒性有所不同。鉴于实际环境中水生动物大多是长期暴露于低剂量的污染物中，所以对于环境暴露剂量下污染物的慢性毒性研究应予以更多的重视。