长链非编码RNA SNHG17通过抑制p57表达促进肺癌进展

2019-05-07张洪波王建东

生物技术通讯 2019年2期

张洪波，王建东

武警北京总队医院胸外科，北京 100027

在全球范围内，肺癌在发病率和死亡率方面是最主要的恶性肿瘤，每年有160 万患者被诊断患有肺癌，超过140 万患者死于肺癌，其中80%是非小细胞肺癌，包括腺癌和鳞状细胞癌[1-2]。由于肺癌的高死亡率和发病率，了解和探究肺癌的发病机制，开发影响肿瘤细胞生长、侵袭和迁移能力的新的预后标志物，将有助于制定有效的治疗策略，提高肺癌患者的生存率，降低其死亡率[3-4]。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类新的非蛋白质编码RNA，最小长度为200 个核苷酸[5]，它不具有实质性的开放读框，可以进行剪接、加帽和多腺苷酸化[6-7]。最近的研究[8-9]表明，lncRNA 可能具有各种生物学功能，包括转录后调节、染色质修饰和其他几种生物学进展。有趣的是，越来越多的研究[10-11]发现lncRNA 在调节各种癌症类型中许多致癌途径中起关键作用，通过充当肿瘤抑制因子或癌基因而与肿瘤的发生进展密切相关。

小核仁RNA 宿主基因17（small nucleolar RNA host gene 17，SNHG17）位于人 20 号染色体上，长度为1186 bp。它属于小RNA的大型非编码基因家族，例如小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）和微小RNA（microRNA），通常位于宿主基因的内含子中。据报道，SNHG17 在结直肠癌和胃癌中表达上调，且与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM 分期相关显著。同时发现SNHG17 通过抑制p57（细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂1C，CDKN1C）表达来调节癌细胞的增殖、细胞周期和凋亡[12-14]。然而，迄今关于SNHG17 在肺癌中的功能意义以及与p57的表达关系尚不清楚。在本研究中，我们探究了SNHG17 在肺癌中的表达及其与p57的作用关系，这将可能有助于预测肺癌患者的预后。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺癌细胞系A549 和H1975、人正常肺上皮细胞BEAS-2B（中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心）；LipofectAMINE 2000 转染试剂、TRIzol 法 RNA 提取试剂盒、RMPI-1640 培养基、胎牛血清（Invitrogen 公司）；Transwell 小室、Matrigel基质胶（康宁公司）；CCK-8 试剂盒（上海碧云天公司）；逆转录试剂盒、SYBR Premix ExTaq（大连 TaKaRa 公司）；GAPDH 抗体（CST 公司）；p57 抗体（Boston 公司）；HRP 标记的羊抗兔二抗（Abcam公司）。

1.2 肺癌组织中SNHG17的组织表达分析

利用starBase 泛癌分析平台（http://starbase.sy⁃su.edu.cn/panCancer.php）挖掘来自癌症基因组图谱（TCGA）的不同癌症类型的mRNA 或lncRNA表达谱。

1.3 细胞培养

采用RPMI-1640 完全培养基，添加碳酸氢钠（22 g/L）、L-谷氨酰胺（0.3 g/L）、青霉素（1 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）和胎牛血清（10%），在37℃、含5% CO2的培养箱中培养[15]。

1.4 RNA提取和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

用TRIzol 试剂从培养的细胞中提取总RNA，用逆转录试剂盒将总RNA 逆转录成cDNA，然后用 SYBR Premix ExTaq进行实时 PCR 分析，将结果标准化为GAPDH的表达，收集数据并分析结果，将其相对于阈值循环（CT）值表达，转换为倍数变化。每个样品一式三份进行分析。用于靶扩增的引物见表1。

表1 实时定量PCR引物

1.5 细胞蛋白表达

采用10% SDS-PAGE 分离细胞蛋白裂解物，转移至PDVF 膜，与特异性抗体一起孵育，孵育完毕加入化学显色液，通过凝胶成像系统（Bio-Rad公司）发光显色。

1.6 细胞转染

将细胞接种于六孔板，每孔约1×106细胞。待细胞融合至80%，用LipofectAMINE 2000 脂质体转染试剂盒转染20 nmol/L siRNA 到细胞中，分别作为阴性对照组（NC）、转染组（si-SNGH17+sip57）及转染组（si-SNGH17）。siRNA 序列包括NC-siRNA（正义链）（5'-UUGUAAUACACCAAAG UACUG-3'）、SNHG17-siRNA（正义链）（5'-GGUG GACCAUGGUGUUCUAdTdT-3'）、p57-siRNA（正义链）（GGACCGAAGUGGACAGCGAdTdT-3'）。

1.7 细胞增殖实验

取对数生长期的细胞，制备单细胞悬液，以2×103/孔接种于 96 孔板，37℃培养 24、48、72 和96 h 后分别进行CCK-8 检测，即每孔加入10 μL CCK-8，4 h 后在酶标仪上测定各孔的D450nm值，以时间为横坐标、D450nm值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.8 细胞迁移实验

取对数生长期细胞，制成悬液接种到六孔板中，37℃过夜培养后再培养24 h，稀释细胞制备单细胞悬液，每种细胞种3 个小室；将Transwell 小室放入含10%胎牛血清的培养基的24 孔板中，继续培养12～24 h 后取出小室；擦去小室内表面未穿膜的细胞，用甲醇固定15 min，DAPI 染核10 min，PBS 洗3 次；于荧光显微镜下观察，并计数5个视野，统计结果。

1.9 细胞侵袭实验

取 60 μL Matrigel 加入 300 μL 无血清培养基中，4℃混匀，加至Transwell 小室，在37℃培养箱中孵育4～5 h 至基质形成固态，剩余步骤同细胞迁移实验。

1.10 统计分析

用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，所有数据均表示为x±SD，组间数据比较采用t检验和方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SNHG17和p57在肺癌组织中的表达水平分析

利用 starBase 数据库分析 SNHG17 和 p57 在肺癌中的表达数据。数据样本中含有526 例肺腺癌、501 例肺鳞癌，并以相对应的正常组织为对照。结果显示，SNHG17 在肺腺癌和肺鳞癌中的表达含量都高于正常组织（图1A、C），而p57 在肺腺癌和肺鳞癌中的表达量都低于正常组织（图1B、D）。通过共表达分析，SNHG17 和 p57 在肺腺癌和肺鳞癌均呈负相关趋势（图1E、F）。

2.2 SNHG17和p57在肺癌细胞中的表达水平分析

通过 qRT-PCR 定量检测 SNHG17 和 p57 在肺癌细胞中的表达水平，本实验采用人肺癌细胞A549、H1975 和人正常肺上皮细胞BEAS-2B 为细胞材料。从图2可见，SNHG17 在肺癌细胞中的表达量明显高于在正常肺细胞中的表达，而p57 在2种肺癌细胞中的表达却显著低于在正常肺细胞中的表达，这与肺癌组织中的表达趋势一致。说明SNHG17 和p57的表达可能存在抑制关系。

2.3 SNHG17沉默抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭

为了探究SNHG17 在肺癌细胞中的作用，选取肺癌细胞A549 转染si-SNHG17。从图3可以看出，si-SNHG17 A549 细胞中的 SNHG17 表达明显下调，而p57的mRNA 和蛋白表达水平均显著上调。同时，与对照相比，si-SNHG17 A549 细胞的增殖速度明显减慢（图4A），迁移和侵袭能力也受到限制（图4B、C），而si-p57 和si-SNHG17 同时转染细胞时，si-SNHG17 对细胞增殖、迁移和侵袭能力的限制作用得到明显缓解（图4）。这些结果表明SNHG17 表达下调使p57的表达上调，从而抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭；同时也进一步证明SNHG17 可能通过抑制p57的表达来促进肺癌细胞的进展。

图1 starBase数据库分析SNHG17和p57在肺癌组织中的表达差异

3 讨论

据报道，lncRNA 是几乎参与所有基因调控的重要调节因子，如表观遗传调控、基础转录机制和转录后调控[16]。通过这种基因调控，lncRNA 可以在多种癌中发挥致癌活性。根据已有研究，SNHG17 在结直肠癌中高表达，并与该病患者的晚期临床分期和预后不良相关，并且通过调节结直肠癌中p57的表达来抑制细胞增殖[12]；另有研究表明SNHG17 在胃癌中同样也高表达，并通过表观遗传调节p15 和p57 来促进胃癌细胞增殖和转移[13]。然而，SNHG17 在肺癌细胞进展中的作用及与p57的关系还不清楚。

本研究中，我们首先通过starBase 数据库分析SNHG17 和p57 在肺癌中的表达，发现SNHG17在肺癌中高表达，而p57 低表达，这与在肺癌细胞中的表达一致；随后的共表达分析发现SNHG17和p57的表达呈负相关趋势，说明SNHG17 可能在肺癌中存在对p57的负向调节。之后，通过沉默SNHG17 研究其对p57 表达和细胞增殖、迁移及侵袭的影响，发现SNHG17 表达下调而p57 表达上调，同时肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力也受到影响，这进一步反证了SNHG17 通过调节p57 表达来促进肺癌细胞的增殖和迁移。