枝孢霉菌生长规律及对喷气燃料性质的影响

牛明明，熊 云，许世海，朱 鹏，孙新枫

(1.陆军勤务学院，重庆 401331；2.宁波大学海洋学院)

喷气燃料在储存、运输、使用过程中不可避免地会有水分进入，燃料添加剂、储运设施含有氮、磷等微量元素，这就为微生物生长繁殖创造了条件。而周围环境中的微生物随水分、灰尘等物质通过呼吸管路进入燃料中，引起喷气燃料微生物污染[1-2]。喷气燃料中的微生物污染不仅影响燃料的腐蚀性、洁净性，而且降解燃料的组分和添加剂，影响喷气燃料的性质[2-6]。研究表明[7-10]，枝孢霉菌是喷气燃料的一种特征真菌，广泛存在于喷气燃料中。三磷酸腺苷(ATP)是生物体重要的能量载体，参与细胞新陈代谢的全过程，在细胞裂解后被释放出来。荧光素酶可在ATP和Mg2+存在的环境下将虫荧光素氧化成带电激发状态，而激发态分子回到基态过程中释放光子[11]。可以通过仪器设备测定反应释放的微弱光，再根据光强度推测ATP含量，进而计算出样品中的微生物含量[12-13]。ATP检测法是国际航空运输协会推荐的喷气燃料中微生物含量的检测方法之一[14]。本研究通过测定不同时间点特征真菌在培养体系水相的发光强度，绘制枝孢霉菌生长曲线，随枝孢霉菌生长繁殖，测定燃料总酸值等理化指标，考察喷气燃料性质随枝孢霉菌生长的变化，为判断燃料污染等级提供依据。

1 实 验

1.1 原料及仪器

试验用油为3号喷气燃料，取自中国石化镇海炼化分公司；试验用真菌为枝孢霉菌，本课题前期培养并鉴定过的真菌，保存于沙保氏平板培养基中；沙保氏液体培养基主要组分为4 g葡萄糖、1 g蛋白胨、100 mL去离子水。

试剂：氢氧化钾、异丙醇、邻苯二甲酸氢钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、吐温80、二甲基硅油、葡萄糖，均为分析纯，成都市科隆化学品有限公司生产；灿烂绿、酚酞，成都市科隆化学品有限公司提供；α-萘酚醌苯基甲烷(对萘酚苯)、氯烃基二甲基苯甲胺由上海麦克林生化科技有限公司提供；蛋白胨，由北京奥博星生物技术有限责任公司提供。

仪器：美国Thermo Fisher公司生产的ECO 1.2超净工作台；日本TOMY Digital Biology公司生产的SX-300快速自动高压灭菌器；郑州市亚荣仪器有限公司生产的SHB-ⅢA循环水式多用真空泵；承德鼎盛试验机检测设备有限公司生产的JYW-200C全自动表界面张力仪；上海泰迈仪器有限公司生产的SPX-30085-Ⅱ生化培养箱；合肥巅峰生物科技有限公司生产的ATP检测仪；南京陵武新技术应用开发研究中心制造的NJ-1A石油产品腐蚀试验多用仪；天津市赛得利斯实验分析仪器公司生产的SHA-A水浴恒温振荡器；上海浦东荣丰科学仪器有限公司制造的202A-3数显电热恒温干燥箱；美国Millipore公司生产的Milli-Q纯水仪；玻璃砂芯过滤装置由上海新亚净化器件厂生产，滤膜0.22 μm。

1.2 试验方法

1.2.1 构建培养体系①用250 mL三角烧瓶配制2组100 mL沙保氏培养液，并在高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min；在超净工作台中，将在沙保氏平板培养基中保存的菌种分别接种至灭菌后的沙保氏液体培养基中，然后将接种后的沙保氏液体培养基放置在恒温摇床上培养3天(转速为180 rmin，温度为27 ℃)。②将清洗后的1 L试剂瓶及过滤装置灭菌(高压灭菌锅中121 ℃灭菌15 min)烘干后，用0.22 μm滤膜过滤喷气燃料，除去喷气燃料中的孢子[15]。③在超净工作台中，用灭菌沙保氏培养液、过滤3号喷气燃料和培养3 天的枝孢霉菌构建如下培养体系：空白样1为150 mL沙保氏培养液+850 mL 3号喷气燃料；空白样2为150 mL沙保氏培养液+菌液；试验样1～试验样5为150 mL沙保氏培养液+850 mL 3号喷气燃料+菌液，其中，试验样1和试验样2用于测定发光强度，绘制枝孢霉菌生长曲线；试验样3～试验样5分别用于测定喷气燃料上部样品、中部样品和下部样品的性质。

1.2.2 枝孢霉菌ATP的检测在试验样1和试验样2中分别接入10，100，1 000 μL菌液，放置于生化培养箱中培养(28 ℃)，每4 h检测一次实验样品水相的发光强度，每个样品检测2～5次，取平均值；分别于试验开始和结束时对空白样水相的发光强度进行检测。试验时先摇动烧瓶中培养体系，使真菌在水相分布均匀后再取样，用灭菌的移液管取1 mL水样与1 mL裂解液在5 mL离心管中混合均匀，然后取50 μL混合液进行检测，计算每毫升水中的微生物量。

1.2.3 喷气燃料的总酸值及培养基pH的检测按照GBT 12574《喷气燃料总酸值测定》方法，每天分别取试验样3～试验样5中的上部样、中部样、下部样检测喷气燃料的总酸值；于试验开始和结束时检测一次空白样1中喷气燃料的总酸值。取样时上部样在油面下方约1 cm处取，中部样在油样中间位置取，下部样在油与培养液界面上方约1 cm处取。

1.2.4 喷气燃料洁净性检测按照GBT 1793《航空燃料水反应试验》方法，磷酸盐缓冲溶液与喷气燃料按体积比为1∶4取样检测喷气燃料下部样的洁净性，同时按照GBT 22237《表面活性剂表面张力的测定》方法测试喷气燃料的表面张力；每天取样前观察油相、水相以及界面处的状态。

1.2.5 喷气燃料银片腐蚀试验按照YLB15—2003方法，检测喷气燃料下部样银片腐蚀的级别，判断是否有活性硫化物产生。

2 结果与讨论

2.1 枝孢霉菌生长规律

以枝孢霉菌培养时间为横坐标，各时间点所测的枝孢霉菌发光强度为纵坐标，绘制枝孢霉菌在培养体系中的生长规律，结果见图1～图3。从图1～图3可以看出：①枝孢霉菌接入培养体系后，由于缺乏充足的中间代谢产物，需要一个短暂的适应期以积累生长繁殖所必需的酶等物质，即迟缓期(0～4 h)，迟缓期内，枝孢霉菌繁殖速率较为缓慢，生长曲线平坦稳定，但代谢活跃，为下阶段生长繁殖储备了充足的酶、能量和中间产物；②经过迟缓期缓慢生长，水相发光强度达到400 RLUmL时，枝孢霉菌开始对数繁殖，生长曲线直线上升，由于初始接入量的不同，枝孢霉菌繁殖生长的基数不同，在100 μL接入量体系中繁殖生长速率比10 μL接入量体系中快，在更大接入量的1 mL培养体系中枝孢霉菌没有经历迟缓期，直接进入对数期快速生长，由于培养体系中营养物质不断被消耗、有机酸等毒性代谢产物的积累以及pH下降等不利因素的影响，枝孢霉菌的繁殖速率逐渐下降，而死亡数目不断上升，最终新增殖数与死亡数趋于平衡，总数处于相对稳定的状态，枝孢霉菌的生长进入稳定期；③枝孢霉菌空白样2(无喷气燃料)与试验样的生长曲线基本一致，说明试验过程中真菌的生长主要利用了水相培养液中的营养物质，并没有大量利用喷气燃料中的成分；空白样2的发光强度有一个陡然下降然后再回升的过程，且培养体系初始接种量越大出现该趋势的时间越早，说明真菌生长繁殖量有一个临界点，超过该临界点时由于营养物质不足会导致真菌数量减少，然后真菌数量再次上升并稳定在临界点附近；试验样的发光强度虽然也有先下降后回升的趋势，但该趋势总体比空白样2平缓，且出现的时间也略晚，说明虽然试验过程中喷气燃料不是枝孢霉菌营养物质的主要来源，但还是为真菌的生长提供了有利条件，促进了枝孢霉菌的生长。另外，试验开始和结束时空白样1(含喷气燃料)的发光强度分别为106.8 RLUmL和120.0 RLUmL，变化不大，说明试验过程中没有外界其他菌种进入培养体系，消除了干扰因素。

图1 10 μL接入量时的枝孢霉菌生长曲线■—试验样1； ●—试验样2； ▲—空白样2。图2、图3同

图2 100 μL接入量时的枝孢霉菌生长曲线

图3 1 mL接入量时的枝孢霉菌生长曲线

2.2 喷气燃料腐蚀性试验

喷气燃料总酸值随时间的变化如图4所示。从图4可以看出，随时间的延长，试验组喷气燃料的总酸值不断增大，8天后试验结束时上部样、中部样、下部样总酸值分别从试验开始时的0.005 3，0.005 4，0.005 5 mgKOHg增加到0.012 8，0.013 5，0.017 1 mgKOHg，下部样的总酸值增加速率和幅度大于中部样和上部样，且第5天起下部样的总酸值已经超出了GB 6537《3号喷气燃料》规定的不大于0.015 mgKOHg的标准。但空白样1在试验开始和试验结束时的总酸值分别为0.005 0 mg KOHg和0.005 7 mg KOHg，在没有外界其他菌种干扰的情况下喷气燃料的总酸值没有明显变化，且酸值在GB 6537《3号喷气燃料》规定范围内。

图4 喷气燃料总酸值随时间的变化■—上部样； ●—中部样； ▲—下部样

培养基pH随时间的变化如图5所示。从图5可以看出，随时间的延长，试验组喷气燃料的pH 呈逐步下降趋势。这可能是枝孢霉菌在生长繁殖过程中产生了酸性物质，小分子有机酸溶于水相，降低了培养液的pH，大分子有机酸溶于油相，增加了喷气燃料的总酸值。另外，试验过程中银片腐蚀级别没有变化，试验结果均为0级，说明试验过程中，枝孢霉菌没有分泌产生或仅分泌极少量活性硫化物，不足以影响到银片腐蚀的试验结果。

图5 培养基pH随时间的变化

2.3 喷气燃料洁净性变化

实验初期，空白样和试验样均清澈透明，油水界面处清洁干净。随着时间的延长，空白样未发生明显变化，但试验样油水界面处产生了一层白色薄膜，并逐渐变厚，局部有小颗粒状物质出现。界面处的白色薄膜可能是枝孢霉菌菌丝相互连接形成的。喷气燃料下部样的表面张力随时间的变化如图6所示。从图6可以看出，试验过程中喷气燃料的表面张力总体呈下降趋势，这可能是枝孢霉菌代谢过程中产生了表面活性物质引起的。表面活性物质会增加油水乳化现象，使油中的水更加难以分离，这一方面会影响喷气燃料的洁净性，另一方面为微生物在油中的生长繁殖创造了条件，会促进微生物的生长繁殖。

图6 下部样的表面张力随时间的变化

水反应试验过程中，油相和水相均不存在乳化物或沉淀，两相界面清澈、清洁，水反应试验分离程度和界面现象均为1级。表明试验过程中枝孢霉菌代谢繁殖产生的表面活性物质虽然降低了喷气燃料的表面张力，但还不足以影响到水反应试验。但长期积累的表面活性物质对喷气燃料的性质有潜在影响，因此需要引起关注。

3 结 论

(1)枝孢霉菌在代谢繁殖过程中产生酸性物质和表面活性物质会增大喷气燃料的总酸值、降低喷气燃料的表面张力和溶解水的pH，同时影响喷气燃料的洁净性。

(2)喷气燃料一旦满足枝孢霉菌生长所需要的水分等条件，枝孢霉菌便会快速生长繁殖。因此在喷气燃料储存、使用、管理过程中，有必要定期检测微生物污染情况，并采取有效处理措施。