G试验在侵袭性念珠菌病中的临床价值

申旺 杨文丽 叶丽燕 谭晓宇 黄晨娟 张鑫

(1.暨南大学附属五邑中医院检验科，江门 529000；2.江门市中心医院病理科，江门 529030)

【关健词】 G试验；念珠菌；曲霉菌；侵袭；诊断

近年来，随着现代治疗手段的大量开展，广谱抗生素和免疫抑制剂的广泛应用，肿瘤、血液病、糖尿病等发病率不断上升，导致侵袭性真菌病(invasive fungal disease，IFD)逐年上升，其中又以侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)为主，约占60%～80%[1-2]。IFD诊断的主要方法是组织真菌培养和镜检，但其检测时间长，阳性率低，常延误患者的诊断和治疗，是造成IFD患者高死亡率的原因之一[3]。近年来，(1,3)-β-D-葡聚糖检测(G试验)成为深部真菌病研究的热点，其在IFD诊断中的价值已得到国内、外研究的认可[2-4]。曲霉菌是除念珠菌外，引起IFD的第二大致病菌，但少见G试验在IC和侵袭性曲霉菌病(invasive aspergillosis，IA)间的比较研究，同时也缺乏G试验在不同IC患者中的诊断价值差异性研究。本实验通过对不同人群G试验水平的比较，探讨其在IC患者诊断中的临床价值及与患者粒细胞、病原菌、体温之间的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2015年9月至2018年6月期间在暨南大学附属五邑中医院住院治疗的侵袭性念珠菌病(IC)患者55例(同时伴有发热≥37.5℃)、侵袭性曲霉菌病(invasive aspergillosis，IA)患者42例(均为肺部或支气管曲霉病)，两组患者均符合《血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则(第四次修订版)》[5]中的深部真菌病确诊组和临床诊断组的诊断指标；同时收集念珠菌黏膜定植组者30例(排除真菌感染，仅痰或中段尿中培养出念珠菌)和健康体检者50名。以上各组研究对象在性别和年龄上均无统计学差异，同时排除近期有输注白蛋白、免疫球蛋白、抗肿瘤的多糖类等药物及近1个月内有过血液透析治疗的患者。本研究通过本院伦理委员会批准，入选对象均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

厦门市鲎试剂实验厂有限公司生产的(1,3)-β-D-葡聚糖试剂，德国ELx808IU酶标仪，沙堡弱琼脂培养基，凯林念珠菌属真菌显色培养基，上海跃进SPX-400-Ⅱ生化培养箱，法国梅里埃BacT/AlerT3D全自动血培养仪及其配套的血培养瓶，法国梅里埃API-20C AUX酵母菌鉴定板和ATB Expression半自动微生物鉴定仪。

1.3 G试验操作和真菌培养鉴定

IC 组和IA组患者于使用抗真菌药物治疗前连续2天抽取2次血液进行 G 试验检测,操作过程严格按照仪器和试剂说明书进行,反应管和吸嘴均去除热原,若两次均为阳性,则以第1次结果为准,若2次结果不相符,则重新抽取标本,以第3次检测结果为准。念珠菌黏膜定植组患者和健康人群于清晨空腹采集静脉血1次进行G试验。以G试验水平≥10 pg/mL为结果阳性。

在患者使用抗真菌药物前，采用无菌方法采集患者的可疑感染标本比如血液、脓液、胸腹水、引流液等，接种血培养瓶或血平板，若有细菌生长，涂片镜检确认为真菌后，再接种于沙堡弱琼脂培养基和真菌显色培养基，30℃培养2～3 d，若无菌落生长则为培养阴性；若有翠绿色菌落生长则为白念珠菌；蓝灰色则为热带念珠菌；粉色为光滑念珠菌；淡粉色和紫色为克柔念珠菌；白色为其他念珠菌，同时结合API-20C AUX酵母菌鉴定板鉴定。

1.4 统计学分析

用SPSS19.0软件对资料进行正态性检验，计量单位采用四分位数M(P25，P75)描述，诊断价值采用受试者工作曲线(ROC)分析，组间比较采用轶和检验，率之间的比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组患者的G试验水平

IC组患者的G试验浓度为73.56(26.80,157.90) pg/mL，与健康正常组、念珠菌黏膜定植组、IA组感染组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 IC患者念珠菌菌种的分布

55例IC患者中，有23例患者培养出白念珠菌，占比为41.82%，低于非白念珠菌58.18%(32/55)。32例非白念珠菌的病原菌包括热带念珠菌12例(21.82%)，光滑念珠菌10例(18.18%)，克柔念珠菌4例(7.27%)，近平滑念珠菌3例(5.45%)，季也蒙念珠菌、角膜念珠菌和葡萄牙念珠菌各1例(1.82%)。

2.3 G试验在IC中的诊断价值

分别以非IFD组(健康正常组和念珠菌定植组)和非IC组(健康正常组、念珠菌定植组和IA组)作为对照组，做G试验诊断IC组患者的受试者工作特征曲线 (receiver operating characteristic curve，ROC)，发现G试验在IC患者中均有较高的诊断价值(AUC分别为0.899、0.782)，见表2。

2.4 G试验在不同IC患者中的阳性率差异分析

以ROC曲线AUC最大的临界点G试验19.05 pg/mL为判断标准，55例IC患者中有43例G试验为阳性，根据IC患者的中性粒细胞数量、体温高低、病原菌类型进行分组。G试验在中性粒细胞正常组中阳性率最高为93.10%，与增高组和减少组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但与粒细胞缺乏组比较，差异有统计学意义(P=0.001)；G试验在白念珠菌感染组中的阳性率最高为86.96%，与热带和光滑念珠菌感染组比较，差异无统计学意义(P=0.699)，但显著高于其他念珠菌感染组，差异有统计学意义(P=0.036)；G试验在中热组中的阳性率最高为82.86%，但与高热组和低热组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表1 各组G试验浓度分析

表2 G试验诊断IC患者的ROC分析

表3 G试验阳性率与IC患者白细胞、体温、病原菌之间的关系

3 讨 论

念珠菌是一种在自然界广泛存在并可寄生于人体的最常见真菌。正常条件下，念珠菌只寄生于人体皮肤、口腔、阴道、黏膜等处，不会导致深部真菌感染，当人体免疫功能低下、生理屏障丧失、菌种失调时，念珠菌可侵入人体组织、器官、血液，导致侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)[6]。由于念珠菌是条件致病菌，IC临床症状缺乏特异性，易被原发疾病或并发症所掩盖，故极易被误诊、漏诊。真菌培养是临床最常见的IC诊断方法，不仅可明确病原菌，还可为临床治疗提供实验室依据，但真菌培养时间长，同时受标本采集不规范、运送过程或接种时易被污染等影响，尤其无法将致病菌和定植菌、污染菌有效区分[7]，故会影响临床医生的诊断，从而延误治疗，这也是导致IC患者高死亡率的原因之一。

(1,3)-β-D-葡聚糖是一种多糖，存在于除隐球菌和接合菌外的所有真菌细胞壁中，当念珠菌侵入人体组织或血液时，可被粒细胞和巨噬细胞吞噬或消化，从而破坏其细胞壁，使(1,3)-β-D-葡聚糖大量释放到血液或体液中，导致(1,3)-β-D-葡聚糖水平升高。当念珠菌定植时，机体未发生炎症反应，念珠菌不会被吞噬，故(1,3)-β-D-葡聚糖也不会释放出来。因(1,3)-β-D-葡聚糖能与马蹄蟹中的一种G凝血因子结合形成蛋白复合物，可根据其浊度的变化程度进行定量检测，故(1,3)-β-D-葡聚糖检测又称为G试验[8]。

本研究中，IC组患者的G试验浓度显著高于健康正常组和念珠菌黏膜定植组，差异有统计学意义(P<0.05)，表明G试验不仅能判断IC感染的发生，还能有效区分其为致病菌还是定植菌。研究也发现IC组G试验浓度显著高于IA组，差异有统计学意义(P<0.05)，这表明G试验可能对致病真菌是念珠菌还是曲霉菌也有一定的鉴别价值，这可能一方面与念珠菌细胞壁(1,3)-β-D-葡聚糖含量比曲霉菌更高有关，另一方面也与研究诊断标准的差异性有关，本研究以在患者支气管肺泡灌洗液中镜检有尖锐分支的、分隔的菌丝即为IA的微生物学标准。

以往认为白念珠菌是IC感染的主要致病菌，但在本研究的55例IC患者中，非白念珠菌感染患者32例，多于白念珠菌的23例，其中非白念珠菌又以热带念珠菌和光滑念珠菌为主(40.00%)，其次为克柔念珠菌和近平滑念珠菌(12.73%)，与秦晓峰等[9]研究略有不符，但和中国侵袭性真菌检测网CHIF-NET的数据[10]基本一致。这表明非白念珠菌已超越白念珠菌成为院内念珠菌感染的主要菌种，这可能与唑类抗真菌药物的大量使用有关[11]。临床医生常用唑类抗真菌药物预防真菌感染的发生，白念珠菌对唑类抗真菌药物有较高的敏感性，克柔念珠菌和近平滑念珠菌也比较敏感，但光滑念珠菌和热带念珠菌对唑类药相对耐药。

本研究分别以健康正常组、念珠菌黏膜定植组和以健康正常组、念珠菌黏膜定植组、IA组作为对照，采用ROC曲线分析G试验在IC患者中的诊断价值，发现G试验不仅对IC具有较高的诊断价值(AUC分别为0.899,0.782)，还能有效区分IC和IA感染。这可能与两者感染部位有关，IC常以念珠血症和播散性念珠菌病为主，易侵入血液，而IA主要感染患者的支气管-肺组织。支气管和肺组织内含有大量气道黏膜分泌的糖蛋白、脂质、蛋白聚糖等成分，一方面可将曲霉包裹起来防止被吞噬细胞吞噬或消化；另一方面即使被巨噬细胞清除，其释放的(1,3)-β-D-葡聚糖也往往局限于呼吸道，较少出现在血中，只有当曲霉生长并伴血管侵犯时，才会释放入血[12]。

本研究发现G试验在IC中的阳性率与患者中性粒细胞含量和念珠菌的种类有关，与体温无关。G试验在中性粒细胞正常组的阳性率最高(93.10%)，与中性粒细胞增高组和减少组比较差异无统计学意义，但显著高于中性粒细胞缺乏组(28.57%)，这提醒对于粒细胞缺乏的患者，G试验可能存在较高的假阴性。粒细胞缺乏常见于肿瘤放化疗、骨髓抑制、免疫缺陷等患者，同时这些也是念珠菌感染的高危因素，但粒细胞缺乏同时可造成免疫应答减弱，导致被粒细胞和巨噬细胞吞噬的念珠菌减少，释放的(1,3)-β-D-葡聚糖也相应降低，使得患者G试验浓度未达到阳性临界线[13]。本研究中的2例粒细胞缺乏G试验阳性的IC患者均是肿瘤连续化疗后导致的，未存在吞噬细胞功能缺陷，其病原菌也均是白念珠菌。本研究也从病原菌角度对G试验阳性率进行了分析，发现白念珠菌IC组患者的G实验阳性率高于其他两组，这可能与白念珠菌定植分布广泛以及其独特的入侵机制有关，一方面白念珠菌被吞噬细胞吞噬后，仍能繁殖如生成芽管并长出菌丝，另一方面在包括树突细胞、粒细胞在内的所有髓系细胞和上皮细胞、肥大细胞等B细胞中均有C型凝集素受体(Dectin-1)的表达，Dectin-1受体的主要作用是识别白念珠菌的(1,3)-β-D-葡聚糖[14]，从而充分激活宿主细胞对白念珠菌的免疫应答，使白念珠菌大量被吞噬消化，促使(1,3)-β-D-葡聚糖释放。有文献[15]指出G试验在近平滑念珠菌深部感染时阳性率偏低，由于本实验中近平滑念珠菌例数较少，未对其进行单独分析，以后将多收集标本例数，进一步研究证实。发热是人体对病原菌入侵产生的免疫应答反应从而产生的一种生理现象，理论上体温升高可加快免疫应答反应，如加速白细胞的增殖和运动，增强巨噬细胞吞噬病原菌的能力等等。但本研究发现G试验阳性率与IC患者体温相差不大，这可能与发热患者使用抗生素等降温药有关，需要进一步研究。

综上所述，G试验对IC具有较高的诊断价值，不仅能有效区分致病菌和定植菌，还对念珠菌感染和曲霉菌感染有一定的鉴别作用。G试验的阳性率与IC患者的体温无关，与中性粒细胞数量和病原菌类型存在一定的关系，尤其在粒细胞缺乏IC患者和除白念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌外的其他念珠菌感染的IC患者中的阳性率偏低。