飞行质谱鉴定临床分离真菌准确度的Meta分析

余甜 林赋桂 胡立冬 李可可 陈晓青 谢跃 时文静 魏莲花

(1.甘肃中医药大学临床医学院，兰州 730000；2.宁夏医科大学临床医学院，银川 750021；3.厦门大学医学院，厦门 361005；4.甘肃省人民医院临检中心，兰州 730000)

近年来，随着影响免疫功能疾病如肿瘤、艾滋病等疾病发病率上升，临床真菌感染率也呈明显上升趋势，尤其是侵袭性真菌及深部真菌感染率[1]。在儿童患者中，因侵袭性真菌病(invasive fungal disease，IFD)而导致死亡率在10%～70%左右，在特定人群中发病率更高，如播散性IFD患者、血液病肿瘤等[2]。目前美国已将白念珠菌列为住院患者第3大常见血流感染病原体，死亡率高达50%，为患者和社会带来了沉重的健康和经济负担[3-4]。由于侵袭性真菌的临床表征不明确，易被基础疾病掩饰，因此实验室诊断尤其重要。欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组(EORTC/IFICC)和美国真菌病研究组(MSG)所制定的诊断标准也将真菌学证据定为确诊证据[5]。常规实验室鉴定真菌流程：首先进行直接镜检根据菌体形态判定菌属，这是最直接也是最有效的方法，常用KOH法、荧光染色法、胶纸粘贴法等。绝大多数标本需要培养后进行鉴定，根据菌落形态以及生化反应鉴定，如显色培养基、API鉴定条、酵母菌的自动化鉴定仪等。而对于丝状真菌主要通过不同染色方法对菌体染色后根据形态进行鉴定。常规流程鉴定真菌所需的时间通常在3～4 d，对实验室人员的技术要求高，成本昂贵，难以鉴定不常见或者生化反应相近的菌株[6]。除此之外，真菌鉴定还可通过检测抗原、或分子生物学方法鉴定，但主要存在技术难度大、以及灵敏度不高等问题。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱系统(MALDI-TOF MS)可在短时间内提供可靠的微生物鉴定结果，可鉴定的菌种现可以达到3000多种，在真菌鉴定方面有快速、准确、经济等优点[7]。其主要原理为：将样本与基质液制备成均匀晶体附着在靶板上，通过质谱中的激光使其电解，电离样品在真空电场中因其不同的质荷比而分离，形成不同的蛋白指纹图谱，通过和数据库中的质谱图谱进行比对未知真菌进行鉴定。本研究的目的是基于循证医学的方法评价MALDI-TOF MS鉴定临床分离真菌的准确性，与传统方法的准确度对比，为临床实验室选择适当的检验手段提供可靠的资料。

1 材料与方法

1.1 检索策略

检索英文数据库PubMed，Web of Science，Cochrane Laboratory，英文检索策略：maldi-ms[MeSH Term]，MALDI-TOF MS，matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry，spectrometry mass matrix assisted laser desorption-ionization，；Fungi [MeSH Term]，Fungus，identification，detection等。中文数据库：CBM、万方、维普、知网数据库，相应的检索策略词：关键词“质谱”、“飞行质谱”、“MALID-TOF-MS”、“真菌”、“鉴定”、“分型”、“诊断”，检索时间为 2018年5月，检索语言包括但不限于中文和英文发表的评价飞行质谱和临床常规方法鉴定临床分离真菌的相关文献。

1.2 研究选择

纳入和排除标准纳入标准：文献同时使用常规方法和MALDI-TOF MS鉴定真菌并统计其正确率的文献；纳入研究菌株数量大于等于80株非重复菌株；纳入研究中必须包含至少一种金标准检测真菌方法，包括但不限于测序、PCR等分子生物学手段；纳入研究中包括前瞻性研究和回顾性研究。排除标准：纳入文献中菌株来源限定为临床分离菌株，排除来源于工业、环境、以及动植物的真菌；排除在MALDI-TOF MS鉴定过程中使用创新方法，例如修改MALDI-TOF MS鉴定中样本预处理过程，样本直接使用阳性培养瓶或尿液等；排除在鉴定过程中使用非商业数据库的文献。

文献筛查和质量评价由两名研究者独立按照纳入与排除标准筛选文献，任何分歧均以协商方式解决。使用修订后的QUADAS(quality assessment for studies of diagnostic accuracy,QUADAS)评价文献质量，包括研究设计、菌株的类别和地理分布、盲态、参考方法、阈值、参考方法和系统数据库等。

数据提取数据时，包括飞行MALDI-TOF MS和常规方法在种、属水平正确鉴定菌株数和总鉴定分离株的数目(排除参考质谱图库中缺少被鉴定菌株的数据)。分别收集不同菌株的种类(酵母菌、丝状真菌)，质谱的型号、鉴定阈值等。此外，还提取了以下信息：第一作者，出版年份，研究设计(前瞻性或回顾性)，临界值，菌株地理分布，是否为盲态、参考方法。我们将菌株鉴定的参考阈值设定为<1.7不可靠鉴定，≥2.0鉴定至种，分数在1.7～1.9之间鉴定至属。

统计学分析使用R软件meta和metafor程序包进行统计学分析，将MALDI-TOF MS和传统方法正确率作为有效分析统计量。在合并正确率时，分别对MALDI-TOF MS鉴定真菌数据(反正弦转换)和常规方法(对数转换)使其符合正态分布[8]。使用Cochran's Q检验和I2来评价文献异质性，分析异质性来源使用亚组分析包括：菌株类别、研究类型、仪器型号、数据库、以及金标准使用范围等，使用Meta回归分析计算亚组合间正确率是否有统计学意义。同时使用随机模型对MALDI-TOF MS方法和常规方法进行的敏感性分析；使用Begg和Egger’s法检测发表偏倚。

2 结 果

2.1 检索结果

使用上述检索策略初步检索到1491条相关文献，剔除重复文献后剩余1154条记录。通过阅读文献标题及摘要排除914篇文献。其中研究目的不符合的文献有760篇，会议论文或者综述116篇，缺少摘要或者病例报道等有38篇。通过阅读文献依据纳入排除标准进一步进行筛选，其中研究目的不符合共有29篇，研究对象不符合纳入排除或者研究数量小于80株的共46篇，研究方法不符合排除纳入标准共103篇，缺少金标准或者未使用常规方法共43篇，最终共筛选出了19篇文献。文献主要信息见表1：在19项入选研究中，7项(36.84%)为前瞻性研究，14项(73.68%)为回顾性研究。只有3篇(15.79%)文章明确指出金标准鉴定全部标本。15项研究包含鉴定酵母菌，7项研究包含丝状真菌鉴定。

2.2 Mate分析结果

在纳入的19篇文献中，共有6609株真菌(酵母菌4741和丝状真菌1868株)，其中有14篇文献中提供了常规方法鉴定真菌数据。在随机效应模式和固定效应模式中分别合并MALDI-TOF MS鉴定临床分离真菌至种(见图1)和常规方法鉴定至种(见图2)，MALDI-TOF MS鉴定临床分析真菌至种水平的正确率在(90%～100%)、常规方法鉴定至种正确率在(67%～100%)，合并MALDI-TOF MS鉴定真菌至种(Q=238.38[P<0.0001],I2=92.9%[95%CI=90.2%～94.8%])；常规方法鉴定至种水平(Q=211.18[P<0.001] ,I2=92.4%[95%CI=89.4%～94.6%])均发现较大的异质性。随机效应模式中，MALDI-TOF MS鉴定真菌至种的正确率0.9368(95%CI=0.9091～0.9598)，常规方法鉴定真菌至种的正确率为0.9104(95%CI=0.8874～0.9340)。

表1 纳入Mate分析文献主要特征

注：争议标本是指待评价实验MALDI-TOF MS和参考实验常规鉴定方法(包括形态学、生化反应等)鉴定结果不一致的标本。

2.3 亚组分析

MALDI-TOF MS将临床分离真菌鉴定至种水平的正确率做一个亚组分析，分析结果见表2，主要包括菌株类型、研究类型、金标准检测标本范围、评分阈值、以及仪器型号等。在亚组分析中，除了金标准检测的全部标本组之外其他亚组异质性没有出现明显下降。添加金标准检测范围后，异质性从整体(Q=120.46 [P<0.001],I2=86.7%[95%CI= 80.2%; 91.1%)下降至(Q=5.82[P=0.1204],I2=48.5[95%CI =0.0-82.9]，除此之外，在评分阈值亚组加入时，Vitek-MS推荐的百分比评分方式异质性出现了明显下降(Q=10.68 [P=0.0581],I2=53.2 [95%CI =0～81.3]。我们利用Meta回归分析比较亚组之间的鉴定正确率是否有统计学意义，结果表明：Vitek-MS和布鲁克公司仪器、不同鉴定阈值、样本处理方法等因素亚组之间正确率具有明显的统计学差异。对MALDI-TOF MS鉴定真菌至种和常规方法鉴定至种的全部研究进行的敏感性分析，通过逐一省略一项研究的方法，结果所示(见图3、4)：没有任何个体研究对物种水平的合并正确率有任何明显的影响。

表2 亚组情况表

图1飞行质谱鉴定真菌至种正确率的森林图图2常规方法鉴定临床分离真菌至种正确率的森林图图3常规方法鉴定至种的敏感性分析图4质谱方法鉴定至种的敏感性分析

Fig.1Forest plot for the meta-analysis of the overall identification ratio at the species level by MALDI-TOF MSFig.2Forest plot for the meta-analysis of the overall identification ratio at the species level by conventional identificationFig.3Influence analysis for the enrolled articles at the species level by Conventional identificationFig.4Influence analysis for the enrolled articles at the species level by MALDI-TOF MS

2.5 发表偏倚

将纳入MALDI-TOF MS鉴定至种的文献和常规方法鉴定至种的文献进行了发表偏倚分析，分别采用Begg和Egger’s检验是否存在发表偏倚分析，结果表明MALDI-TOF MS鉴定真菌至种无发表偏倚(Begg[z= -0.37905；P= 0.7047]; Egger’s[ t= -0.82114;P= 0.4236])，常规方法鉴定真菌至种有一定的发表偏倚(Begg[z=-3.5426;P=0.0003963]; Egger’s[t=-5.7959 ;P= 3.527e-05])。

3 讨 论

飞行质谱技术(MALDI-TOF MS)是一种从蛋白质组学水平鉴定病原微生物的技术，它具有快速、高效、经济等多项优点。本研究纳入19篇原始研究比较MALDI-TOF MS和常规方法鉴定临床分离真菌的准确度，通过合并单一率的荟萃分析方法得出:MALDI-TOF MS鉴定正确率0.95(95%CI=[0.93～0.96]),常规方法鉴定至种的正确率为0.91(95%CI=0.89～0.93)，这些数据可以得出MALDI-TOF MS是现在常规方法的可靠的替代方法。本研究中，我们MALDI-TOF MS型号对临床分离真菌正确率分析，其中Vitek-MS表现的比较出色，鉴定真菌至物种水平上正确率0.9684(95%CI=[0.9530～0.9809])，由于没有直接对三种MALDI-TOF MS仪器型号进项双盲研究并不能直接得出Vitek-MS的准确率优于其他飞行质谱系统。Autoflex鉴定的准确率0.9565(95%CI=[0.8977～0.9910])优于Microflex鉴定准确率0.9231(95%CI= [0.8717～0.9622])，Autoflex是布鲁克在Microflex基础上优化及改进发布的一种精确度更高的新型号设备[9]。

在临床实践过程中，真菌的鉴定难度比酵母菌更加高，常规方法的研究中可明显的看出，常规方法鉴定酵母菌的正确率0.9085(95%CI=[0.8776～0.9406])，而鉴定丝状真菌的正确率0.8643(95%CI=[0.7959～0.9385])。MALDI-TOF MS鉴定正确率也表现出这一特点，鉴定酵母菌正确率0.9311(95%CI=[0.8902～0.9630])，鉴定丝状真菌的正确率0.8598 (95%CI=[0.7393～0.9473])，MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌的难度主要原因是丝状真菌的蛋白质提取难度更大，MALDI-TOF MS操作要求涡旋研磨或者玻璃珠等方法处理，同时商业参考库中丝状真菌物种的光谱数量不足。影响MALDI-TOF MS鉴定结果的因素还有菌株蛋白获取方法，通常有甲酸提取方法和直接涂布在靶板上再滴加甲酸的方法提取，本研究对两种方法进行了亚组分析，结果表明两种方法的鉴定正确率有明显的差异(P=0.0496)。本研究中评价了不同公司评分阈值对鉴定正确率的研究，研究结果表明：鉴定至种的阈值纳入文献中共有两种(≥2.0；≥1.8)，适当降低评分阈值可以提高鉴定正确率。这一点在鉴定至属(>1.7)水平也有所体现。在比较合并正确率的比较中，可以明显看出鉴定至种(≥2.0；≥1.8)的两种阈值之间无明显差异(P=0.1126)，而鉴定至种、鉴定至属、以及百分比评分方式之间正确率是有明显差异(见表2)。

在临床研究中，由于缺乏直接的对比，将更精细的双变量荟萃分析模型应用于临床病原体鉴定工具的评估通常是不可行的，因此本研究只能采用单一率的Meta分析[10-11]。单一率的荟萃分析的稳定性与双变量荟萃分析的稳定性相比，在多数情况下会出现明显的异质性，正如先前发表的文献所证明的一样[12-14]。本研究从以下几个临床原因分析异质性来源：①地域分布原因，真菌疾病呈现一定的区域性[15]，本文中纳入的研究主要集中在欧洲、北美洲、以及亚洲的少数国家，因此菌株类型也有所限制。②研究类型，本文中纳入的研究类型大多数是回顾性研究，仅21.05%研究遵循盲法规则，这两者均会降低研究质量。③金标准检测范围，目前公认的金标准是测序，纳入研究中仅有3篇文献使用金标准检测了全部标本，其他研究均只检测了金标准和常规方法鉴定结果出现差异的标本，这种情况会过高估计MALDI-TOF MS鉴定真菌的能力。④数据库更新，本研究中排除了自建真菌数据库、以及商业数据库和自建库补充的文献，主要原因是为了MALDI-TOF MS鉴定真菌的正确率具有普遍参考意义，同时也避免了因为质谱数据库的巨大差异影响合并正确率的结果。据了解，商业数据库以大约3～6个月的间隔不断改进和更新，本研究中文献跨度较大因此依旧具有明显的异质性。此外，本文中MALDI-TOF MS鉴定真菌的研究中不存在发表偏倚，在常规方法种存在一定的发表偏倚，主要原因是真菌的鉴定在临床应用方面普及度差、对技术人员要求高，所发表文献中常规方法鉴定正确率偏高、以及存在发表偏倚的问题。

MALDI-TOF MS作为一种新型的鉴定病原微生物的全新技术，具有很多独特的优势。尤其是在缩短鉴定周期、节约成本、以及降低实验技术人员的技术要求等。目前，MALDI-TOF MS在直接鉴定血培养阳性瓶病原微生物，微生物分型[16]及药敏实验等方面[17]。本研究得出的结论显示MALDI-TOF MS是一种对临床分析真菌具有较高鉴定准确度的技术，这项技术是现在临床常规实验方法的可靠替代技术。