绿茶糖苷类黄酮对酒精肝纤维化小鼠肝组织及肝功能的影响

陈洁静，段雪琳，徐培康，黄远炉，袁丽兰，王 琳

（广西中医药大学，广西 南宁 530200）

近几年，肝硬化死亡的人数不断上升，其中长期慢性的胆汁淤积造成的胆汁性肝硬化占主要原因［1］。研究表明，肝纤维化、早期肝硬化通过临床有效干预是可以达到完全逆转的［2-4］。中医药在肝纤维化的治疗上积累了丰富的经验，具有疗效显著、副作用少等优势［5-8］。绿茶中的有效成分糖苷类黄酮能有效减少多个炎症介质的表达，从而减轻半乳糖胺所致的大鼠肝损伤［9］，但其能否改善肝纤维化尚未见有报道。本实验研究绿茶糖苷类黄酮对酒精肝纤维化小鼠肝组织及肝功能的影响，探索绿茶糖苷类黄酮在延缓肝纤维化中可能存在的机制，为防治肝纤维化的药物开发提供基础数据。

1 实验材料

1.1 动物 清洁级小鼠60只，雄性，体质量20±5 g，购自广西医科大学实验动物中心（合格证号：SCXK桂2009-0002）。

1.2 试剂 谷丙转氨酶（ALT）试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号：20170705）；95%酒精（成都科龙化学试剂厂，生产批号：2017012201）；秋水仙碱（西双版纳版纳药业有限公司，国药准字H53021369）。

1.3 试药 绿茶为市售品，参照文献［10］提取绿茶糖苷类黄酮。将绿茶剪碎，加适量蒸馏水浸泡0.5 h后煎煮1h，过滤，取茶渣加适量水再次提取1h。将两次绿茶水煮液合并，水浴浓缩。在浓缩液中加入95%酒精适量，使含醇量达80%，静置数小时，取上清液置旋转蒸发仪中进行减压浓缩，回收溶剂加入沉淀物，搅拌静置。多次重复上述步骤，直至上清液的颜色明显变淡。取浓缩上清液浸膏加适量水溶解，湿法上样，过D101大孔树脂，分别用水和30%、50%、70%的酒精依次洗脱，收集30%、50%、70%酒精流份，再用80%酒精通过旋转蒸发仪回流提取减压浓缩。取浓缩液，充分干燥后粉碎成粉末状，备用。粉末经检测为黄酮类化合物，经定量分析，得到黄酮含量为847 g/kg，用时以蒸馏水稀释为4.24 mg/L、10.59 mg/L、21.18 mg/L 的浓度。

2 方法

2.1 分组与造模 将60只小鼠随机分为6组：正常对照组、模型组、秋水仙碱组及绿茶糖苷类黄酮低、中、高剂量组。除正常对照组外，余组动物每天灌胃给予50%酒精5 ml，连续灌胃4周，制作肝纤维化模型。正常对照组小鼠灌胃给予生理盐水5 ml，连续灌胃4周。末次灌胃后24 h，随机从各组抽取2只小鼠，统一采集小鼠肝左叶上缘，HE染色后镜下观察，以小鼠肝组织有不同程度的炎细胞浸润、假小叶形成和肝纤维化为酒精肝纤维化造模成功。

2.2 给药干预 第5～8周，秋水仙碱组按0.15 mg/kg灌胃给予秋水仙碱，灌胃容量为5 ml/d；绿茶糖苷类黄酮低、中、高剂量组分别按 1 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg灌胃给予绿茶糖苷类黄酮，灌胃容量为5 ml/d；正常对照组和模型组灌胃给予等量生理盐水。每组均于每天18∶00～19∶00 给药干预 1 次，常规饮水喂养，其他实验条件相同。

2.3 样本采集与处理 末次给药后24 h，将小鼠固定，眼眶采血后处死，采集小鼠肝左叶上缘。取小鼠的眼球血，3 000 r/min连续高速离心15 min，取离心上层血清。再以微孔滤膜（0.22 μm）过滤除菌，置于-20℃的冰箱储备。应用722-分光光度计检测各组小鼠血清吸光度，依照ALT试剂盒说明书，计算出小鼠肝功能指标ALT数值。取小鼠肝脏左叶上缘组织，固定、脱水、包埋、切片，在HE染色显微镜下观察小鼠肝组织的形态、病理变化，并对小鼠肝纤维化程度进行评分、分期。

2.4 统计学处理 采用SPSS20.0软件分析实验数据。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况 死亡小鼠：实验中共有6只小鼠死亡，其中正常对照组2只，模型组3只，绿茶糖苷类黄酮中剂量组1只。行尸检、病理分析，模型组3只死于急性肝衰竭，正常对照组2只和绿茶糖苷类黄酮中剂量组1只为灌胃过程中小鼠突发急性窒息，以上小鼠不纳入统计。存活小鼠一般状态观察：正常对照组、秋水仙碱组、绿茶糖苷类黄酮高剂量组小鼠精神良好、毛发光滑、反应灵敏；模型组精神萎靡、毛发粗糙、好静；绿茶糖苷类黄酮低、中剂量组介于上述两者之间。肝脏大体标本显示：正常对照组、秋水仙碱组、绿茶糖苷类黄酮高剂量组小鼠肝脏大小适宜、色泽红润，质软；模型组色暗沉，质稍韧，表面较粗糙，形体偏小；绿茶糖苷类黄酮低、中剂量组则介于上述两者之间。

3.2 各组小鼠ALT水平比较 见表1。

表1 各组小鼠血清ALT水平比较 （±s）

表1 各组小鼠血清ALT水平比较 （±s）

注：与正常对照组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01；与绿茶糖苷类黄酮高剂量组比较，③P＜0.05

组 别 n 剂量（mg/kg）小鼠血清ALT（U/L）正常对照组 6 — 22.88±4.57模型组 5 — 88.93±4.22①秋水仙碱组 8 0.15 49.34±3.42②绿茶糖苷类黄酮低剂量组 8 1 63.70±2.16②③绿茶糖苷类黄酮中剂量组 7 2.5 59.40±2.77②③绿茶糖苷类黄酮高剂量组 8 5 54.21±18.09②

表1结果显示，与正常对照组比较，模型组小鼠血清ALT水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各用药组小鼠血清ALT水平显著降低（P＜0.01）；与绿茶糖苷类黄酮高剂量组比较，绿茶糖苷类黄酮低、中剂量组血清ALT水平有显著性差异（P＜0.05），呈现出一定的量效关系。

3.3 各组小鼠肝脏病理学比较

3.3.1 各组小鼠肝组织病理学观察 见图1。正常对照组：肝组织未见明显异常；模型组：汇管区胶原结缔组织增生，小胆管增生，可见桥接纤维化，有大量肝细胞脂肪变，中央静脉周围肝细胞内和小胆管内可见淤积胆汁；秋水仙碱组和绿茶糖苷类黄酮高剂量组：小叶结构基本存在，肝细胞脂肪变，胶原纤维增生，窦周纤维化；绿茶糖苷类黄酮低、中剂量组：汇管区纤维增生，肝细胞脂肪变。

图1 各组小鼠肝组织病理切片（×400）

3.3.2 各组肝组织病理Ishak评分比较 按文献［11］进行肝纤维化Ishak评分。0分：无纤维增生；1分：有部分纤维增生，纤维隔膜少或无；2分：有较多的纤维增生，纤维隔膜有或无；3分：有较多的纤维增生，纤维桥连偶见；4分：有较多纤维增生，纤维桥连明显；5分：明显的桥连，偶见不完全硬化性结节；6分：明确或可能有肝硬化。结果见表2。

表2结果显示，与模型组比较，各用药组肝纤维化Ishak评分显著下降（P＜0.01），表明绿茶糖苷类黄酮对改善肝纤维化有一定作用。

表2 各组小鼠肝纤维化Ishak评分比较 （±s）

表2 各组小鼠肝纤维化Ishak评分比较 （±s）

注：与模型组比较，①P＜0.01

组 别 n 剂量（mg/kg）肝纤维化Ishak评分（分）正常对照组 6 — 0模型组 5 — 5.80±0.45秋水仙碱组 8 0.15 0.38±0.52①绿茶糖苷类黄酮低剂量组 8 1 1.75±1.39①绿茶糖苷类黄酮中剂量组 7 2.5 0.86±0.69①绿茶糖苷类黄酮高剂量组 8 5 0.63±0.52①

4 讨论

肝纤维化是以大量细胞外基质沉积为主要病理特征的一种代偿性损伤愈合反应，肝纤维化严重时可以转变成肝硬化［12-14］，肝纤维化患者或无明显临床症状，或表现出食欲减退、全身乏力、消化不良、不明原因出血等非特异性临床表现，常不能引起患者的重视，大多数在体检时偶然发现。山茶科草本植物绿茶，其主要成分糖苷类黄酮可减轻肝损伤，减少炎症介质的表达［9］，本课题组推测其在肝纤维化的改善上也具有一定的作用。

本实验采用绿茶糖苷类黄酮干预酒精所致肝纤维化小鼠，以秋水仙碱为阳性对照，结果显示，与模型组比较，绿茶糖苷类黄酮低、中、高剂量组小鼠一般情况，如精神状况、食欲、毛发色泽等良好。肉眼肝脏大体标本见肝色鲜艳、质软，形态大小适宜。HE染色镜下示肝病变程度均有所降低。ALT作为肝功能检测的最敏感指标，当肝细胞出现1%损伤，血清中的ALT水平便可达到正常水平1倍以上［15］。ALT可独立反映肝病发展程度，与肝组织病变密切关联。本文研究表明，与模型组比较，绿茶糖苷类黄酮低、中、高剂量组小鼠血清ALT表达水平均显著降低（P＜0.01），呈现一定的量效关系；且肝纤维化Ishak评分也显著下降（P＜0.01）。以上结果提示，绿茶糖苷类黄酮对酒精肝纤维化在护肝、改善肝纤维化上有一定的作用。

本实验结果与部分已有文献结论相吻合，由于仅作为初步的探索，尚存在检测指标较少、实验小鼠数量不足等缺陷，下一步还应加大研究深度，探讨其作用机制及潜在靶点，进一步明确绿茶糖苷类黄酮对肝纤维化的作用，为肝纤维化防治研究提供参考数据。