MiR-145-5p对胶原诱导的关节炎小鼠关节炎症的影响

明建松 ，王晓雪 ，杨梦晨 ，汤 可 ，袁玉华

（1.天津医科大学总医院检验科，天津300052；2.天津港口医院检验科，天津300456）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的慢性并累及多个关节的自身免疫性疾病，它的发病机理是一种涉及到多种细胞、细胞因子和免疫活性物质的复杂过程，其发病机制尚不完全清楚。近几年发现microRNA参与免疫应答反应，可能在RA的疾病进展中发挥重要作用。前期实验发现，miR-145-5p在RA中与对照组骨关节炎（OA）滑膜组织和滑膜细胞相比，在RA外周血单个核细胞（PBMC）、滑膜组织和成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）中miR-145-5p水平显著增加[1]。通过调节ADAM17的表达，miR-145-5p调节RA-FLS的增殖、细胞周期进程和炎性细胞因子的表达；通过下调Ets-1，miR-145-5p模拟上调IL-17水平和基质金属蛋白酶MMP-3，MMP-9和MMP-13的表达。现结合胶原诱导的关节炎CIA小鼠模型，增强miR-145-5p表达，观察CIA小鼠关节变化情况，分析miR-145-5p在CIA中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 DBA/1小鼠36只，雄性，8周龄左右，SPF（Specefic Pathogen Free，无特定病原体）级，体质量（20±2）g，由北京华阜康公司提供，标准饲料喂养，自由饮水、饮食，适应性饲养7 d，进行实验。动物于天津医科大学总医院饲养。本研究经天津医科大学动物护理与使用委员会批准。

1.2 试剂 牛Ⅱ型胶原（液）及弗氏完全佐剂购于美国chondrex公司，agomiR-145-5p购于中国广东Ribobio公司，小鼠麻醉剂水合氯醛购于美国sigma公司。将冻干的牛II型胶原蛋白在4℃下在0.05 mol/L乙酸中过夜溶解，在弗氏完全佐剂中乳化至最终浓度为2 mg/mL。

1.3 CIA小鼠模型建立 取36只8周龄，雄性DBA/1小鼠，适应性饲养2～3 d之后，随机分组选出10只小鼠作为miRNA阴性对照（miR-NC）组，其余作为模型构建组，进行初次免疫。按照每只100 μL牛Ⅱ型胶原进行根部皮下注射，注射部位为距尾根部2 cm至0.5 cm区间，miR-NC组按同样方法注射等体积的生理盐水。初次免疫21 d后，进行加强免疫，模型构建组每只小鼠腹腔注射100 μL牛Ⅱ型胶原，miR-NC组同样方法注射等体积生理盐水。

1.4 成模小鼠免疫及分组给药 加强免疫后，每天观察记录小鼠精神状态及关节肿胀情况，筛选出发病时间相近的关节炎指数大于4分的发病小鼠20只，随机分为agomiR-145-5p组及agomiR空载体（agomiR-NC）组，每组10只，在初次免疫后第30天将等体积的agomiR-145-5p和agomiR-NC进行鼠尾静脉注射，之后每隔3 d注射1次，共进行3周。

1.5 关节评分观察及CIA小鼠足跖肿胀程度比较 加强免疫后，隔天观察诱导小鼠关节肿胀情况；于小鼠分组治疗后，每天进行关节炎评分，记录关节炎指数（AI），相加得总评分[2]。

1.6 micro-CT扫描 小鼠膝关节和踝关节在固定后进行micro-CT扫描重建。

1.7 病理分析及免疫组化检测 用10%水合氯醛（0.04 mL/10 g）麻醉小鼠后，处死所有小鼠。取小鼠踝关节进行固定、脱水、透明，并用石蜡包埋切片，进行HE染色，镜下观察小鼠关节病变情况。通过对小鼠踝关节组织切片进行免疫组化染色，检测MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13、IL-17和 ADAM17 的表达。

1.8 统计学分析 采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料采用±s表示，采用配对样本t检验进行分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 模型建立及关节炎评分指数变化情况 对DBA/1建模，约85%小鼠成功建立CIA模型，足部出现关节炎症状。对小鼠四肢进行评分记和。与agomiR-NC组比较，agomiR-145-5p组的小鼠在给药后第4天关节炎评分指数开始相对下降（P＜0.05）（图 1）。

2.2 小鼠足部变化 miR-NC组小鼠足部呈正常粉红色，足掌、踝、掌指及指关节均无肿胀。发病小鼠足掌增厚、多关节红肿，行走不便，急性期受累足不能负重。胶原诱导成功小鼠足厚度、足体积较miR-NC组小鼠高。agomiR-145-5p治疗后部分减轻了小鼠足部的肿胀和发红（图2）。

图1 CIA小鼠的关节炎评分Fig 1 Arthritis scores for CIA mice

图2 注射前后CIA小鼠的后爪Fig 2 Hind paws of CIA mice before and after injection

2.3 HE染色观察miR-145-5p对CIA小鼠关节软骨损伤的治疗效果 HE染色结果如图3所示，与miR-NC组比较，agomiR-145-5p组小鼠膝关节滑膜组织明显增生肥厚，滑膜周围结缔组织中有大量淋巴细胞和少量中性粒细胞浸润，有丰富的血管翳形成，关节软骨及软骨下骨侵蚀破坏严重。与agomiR-NC组比较，agomiR-145-5p组滑膜增生显著降低，骨破坏显著增强（P＜0.05）（图 4）。

图3 来自CIA小鼠后爪切片的HE染色Fig 3 Hematoxylin and eosin staining of sections from the hind paws of CIA mice

图4 CIA小鼠的组织病理学评分Fig 4 Histopathological scores of CIA mice

2.4 micro-CT扫描评价miR-145-5p治疗对CIA小鼠关节损伤的影响 与miR-NC组比较，agomiR-145-5p组与agomiR-NC组都表现出踝关节的骨侵蚀；与agomiR-NC组相比较，agomiR-145-5p组骨侵蚀更严重（图5）。

图5 骨破坏的比较Fig 5 Comparison of bone destruction

2.5 免疫组化检测 与agomiR-NC组相比较，agomiR-145-5p组小鼠的后踝中MMP-3，MMP-9，MMP-13和IL-17蛋白水平增加，MMP-1水平没有差异，ADAM17蛋白减少（图6）。

图6 CIA小鼠的MMP-1，MMP-3，MMP-9，MMP-13，IL-17和ADAM17的免疫组化检测Fig 6 Immunohistochemistry （IHC）and quantification of MMP-1,MMP-3,MMP-9,MMP-13,IL-17,and ADAM17in CIA mice

3 讨论

为进一步明确miR-145-5p在RA关节软骨损伤中的作用，本实验选用造模成功率高的DBA/1小鼠，通过II型胶原和完全弗氏佐剂混合尾根部皮下注射的方法制备CIA小鼠模型，初次免疫后4周，小鼠出现足爪红肿、活动受限等RA相关症状，由此可见本实验所建立的CIA模型是成功的。通过关节评分、micro-CT分析、病理分析及免疫组化检测等相关实验发现miR-145-5p加重关节破坏的同时部分抑制了CIA小鼠的关节炎症，同时发现与agomiR-NC组相比较，agomiR-145-5p组小鼠的后踝中 MMP-3，MMP-9，MMP-13 和 IL-17 蛋白水平升高，MMP-1水平没有差异，ADAM17蛋白水平降低。

ADAM17是一种TNF-转换酶，被鉴定为切割TNF-α前结构域的酶，并且被认为是在炎症反应期间负责释放TNF-α的主要蛋白酶[3]。另外，据报道ADAM17通过激活EGFR/PI3K/AKT途径促进神经胶质瘤细胞的增殖和侵袭[4]。本实验相关实验的结果证实ADAM17促进FLS增殖并且还表明ADAM17减少RA-FLS中的TNF-α产生。此外，敲减ADAM17减少TNF-α产生并增加miR-145-5p以及IL-17和MMPs的表达，这可能表现为miR-145/ADAM17/TNF-α的反馈环。据报道，FLT1，TLR4，TGFB2和APRIL分别与炎症反应有关，涉及RA中的细胞增殖、细胞周期、炎性细胞浸润和血管生成[5-8]。今后需要进一步研究miR-145-5p是否可以 直 接 降 低 ADAM17，FLT1，TLR4，TGFB2 和APRIL的表达，从而抑制炎症反应。

IL-17主要由Th17细胞释放，Th17细胞是一种特殊类型的人类辅助性T细胞[9]。这种细胞因子在炎症和包括RA在内的自身免疫性疾病的发展中起着至关重要的作用[10]。研究表明，IL-17诱导RA中MMP-3，MMP-9和MMP-13的产生[11-12]。众所周知，RA患者的骨和软骨破坏部分由MMP活化的滑膜细胞和软骨细胞构成[13]。此外，Ets-1被报道为Th17分化的负调节因子。miR-145过表达导致RA-FLS中IL-17，MMP-3，MMP-9 和 MMP-13 水平升高与Ets-1水平降低的相关性，以及RA-FLS中Ets-1调节IL-17的机制仍需进一步深入研究。

即使CIA小鼠模型中关节炎症被部分抑制，施用miR-145-5p也会加重骨破坏，说明miR-145-5p可能调节多种信号通路，例如miR-146a和miR-155与炎症反应和RA疾病呈正相关，但在关节破坏中起负面作用[14-15]。这项研究证实了RA中miR-145-5p介导的基因调节的复杂性，为后续研究提供了参考。