新疆罗勒挥发油活性成分的网络药理学研究

阿地力江·萨吾提，艾尼瓦尔·吾买尔，买尔旦·玉苏甫，吉米丽汗·司马依，阿布来提·阿布力孜,艾合麦提江·纳曼，艾再提·克热木，周文婷

(新疆医科大学药学院药理教研室，新疆 乌鲁木齐 830011)

随着现代医学的日益发展与深入研究，人们开始逐渐认识到疾病治疗需要干预多个靶点和多条信号通路。中医药治疗疾病具有整体观和辨证论治的特点,而且在治疗复杂疾病方面显示出了更好的预期效果。中药及其复方具有多成分、多靶点协同作用的特点，这种复杂特征成为解释中药物质基础和作用机制的一个瓶颈。因此，天然药物主要有效成分的多靶点研究和配伍研究，成为新一代药物研究的热点。

罗勒(OcimumbasilicumL.)为唇形科罗勒属，1年生草本植物。味辛、性温，其全草部分和种子均可入药，具有疏风解表、解毒消肿、强心安神、化湿和中、消散瘀肿、行气活血、止痛等功效[1]。在我国主要生长在新疆、四川、云南等地。化学成分主要有挥发油、酚酸，黄酮、甾体类化合物。众多研究表明[2]，罗勒水提物或醇提物有细胞毒性、清除自由基、抗炎、抗肿瘤、抗菌/抗毒、降血脂、抗动脉粥样硬化等药理作用。虽然罗勒药理作用丰富，其作用机制尚未完全阐明，为此，系统揭示罗勒主要活性成分及其药理作用机制具有重要意义。

近年来，基于网络药理学研究天然药物越发被人们关注。网络药理学从整体的角度研究药物与疾病间的联系，将药物-靶点网络与生物系统网络相结合，基于系统生物学，联合应用多向药理学、生物分析等多种学科，经过不同网络模型的可视化表达，阐明中草药的药理学性质。这种新方法特别适合用于反映天然药物的多成分-多靶点的作用关系。网络药理学这一概念的提出，突破了单一靶点作用于单一疾病的思想限制，为研究中药及其复方中的潜在活性成分和作用靶点，提供了有效的研究策略[3]。本文以网络药理学及公开的文献报道为基础，利用多种数据库资源，系统研究了罗勒挥发油的活性成分、治疗疾病的靶点及其主要作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料PubChem(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)、DrugBank (https://www.drugbank.ca/)等数据库，获取罗勒挥发油成分规范化的三维分子结构描述符，SIB(https://www.sib.swiss/)数据库检索出挥发油成分的药动学参数及靶点信息，根据UniProt(http://www.uniprot.org/)数据库中的靶点信息作为统一标准，利用治疗靶点(therapeutic target disease，TTD, https://db.idrblab.org/ttd/)数据库，检索疾病靶点，经KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，http://www.genome.jp/kegg/)数据库，检索出预测靶点对应的疾病靶点通路。

1.2 成分收集及整理罗勒挥发油化学成分的收集按照以下几个标准进行：① 通过文献已经公开报道的新疆地区罗勒挥发油成分；② 罗勒中已经定量的挥发油化学成分。对收集到的成分进行预处理及标准化，去除离群样本和多余的分子描述，最终将成分名称输入PubChem数据库，检索出规范化的三维分子结构描述符，用于后续的数据分析。

1.3 活性成分的筛选按照上述标准整理到的罗勒挥发油规范化的三维分子结构描述符，输入到SIB(http://www.swissadme.ch)数据库中，导出化学成分相关的药动学参数，根据ADME参数选出具有生物活性的成分，进一步研究。

1.4 成分靶点预测预测到的活性成分，按照同样的方法在Swiss Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)中检索，获取成分靶点，并利用UniProtKB (http://www.uniprot.org/)核对靶点信息、筛选并整理，利用DAVID数据库进行靶点蛋白的富集分析。

1.5 成分-靶点网络的构建收集到的活性成分及对应的预测靶点输入到Cytoscape6.0网络可视化软件中，构建成分-靶点(compound-target，C-T)网络，基于边数、节点、关联性设置颜色、大小。

1.6 疾病靶点网络的构建活性成分预测到的靶点，利用治疗靶点疾病数据库TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)、KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/)等检索平台，获取其相关的疾病靶点及靶点通路信息，进行整理。

2 结果

按照成分收集标准，在已经公开的文献报道中整理出了134个罗勒挥发油成分，对这些成分进一步研究。

2.1 成分筛选标准及结果口服生物利用度(oral bioavailability，OB)是药物吸收、分布、代谢、排泄(absorption,distribution,metabolism,excretion，ADME)特性中尤为重要的参数之一，它表示单位口服剂量产生药效的百分数，在Swiss中，胃肠道吸收的高低被用来指示口服生物利用度。较高的OB值是表明药效分子及类药性的关键指数。药效可以影响ADME过程，因而导致药物生物利用度的变化[4]。细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)和P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)均能在胃肠道中高度表达，且两者的底物能够相互重叠，因此，肠道细胞CYP450 对已吸收药物的生物转化作用和肠道细胞中P-gp对已吸收药物的主动外排作用是影响OB的重要因素[5]。影响药物生物利用度的这些同工酶的抑制，进一步影响了药物-药物相互作用，药物或其代谢物在体内累积，进一步导致了药物的毒性或其他不良反应。Swiss ADME中CYP450及P-gp作为界定OB的参数，进一步提高了数据的可靠性。

质量高的化合物应该具备一些良好的化合物特性，其中包括类药性(drug-likenesses，DL)。DL是指有良好的临床疗效药物的物理化学性质及生物学特性(包括ADME/Tox)。Lipinski指出,类药化合物系具有足以被人体接受的ADME特性和安全性，在I期临床试验结束后，待进行下一步实验的化合物[6]。从生物学角度看，DL总和了药代动力学性质与药物的安全性。Swiss ADME提供了5种不同规则的药物相似性指标(Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge)。在活性成分的筛选中，我们选择了典型的Lipinski五项原则作为活性成分的筛选标准。

最初按照标准，从文献[7-11]来源的134个罗勒挥发油成分，从PubChem等数据库获取其规范化的三维分子结构描述符，经Swiss ADME获取相关的化学成分参数，根据药动学参数中OB与DL筛选活性成分，最终从134个挥发油中筛选出了6个有生物活性的成分(Tab 1)。这些成分分别为棕榈酸(hexadecanoic acid，含量为0.7)、十六酸甲酯(methyl hexadecanoate，含量为0.5)、9,12-十八碳二烯甲酯(9,12-octadecadienoic acid，含量为0.1)、亚麻酸(linolenic acid，含量为13.83)、亚麻酸甲酯(linoleic acid methyl ester，含量为0.32)、6,10,14-三甲基十五烷-2-酮(6,10,14-trimethylpentadecane-2-one，含量为0.09)，均表现为高胃肠道吸收、高类药性和较高的生物利用度。

Tab 1 Active ingredients of essential oil of Ocimum basilicum L.

*Lipinski's rule of five also known as the Pfizer′s rule of five or simply the rule of five(RO5), including the rule of MW≤500, MLOGP≤4.5, N or O≤10, NH or OH≤5; All of these six active ingredients were violated by MLOGP>4.15 respectively.

2.2 蛋白预测结果与分析具有生物活性的生物小分子与蛋白质或其他大分子结合，从而调节其活性[12]。因此，预测有生物活性小分子的靶标是揭示其药物活性，以及预测其潜在的副作用或交叉反应的关键步骤。Swiss Target Prediction是通过二维和三维结构的相似性，来测量成分与已知配体的组合，准确预测分子靶点的一个免费的网络数据库。该数据库是通过已知配体的2D和3D结构相似性，来预测出待测成分的作用靶点。对活性成分进行靶点预测，最终得到了6个活性成分相对应的91个蛋白靶点。将这些靶点进行整理，最终获取了与人类同源性的25个不同的相关蛋白靶点(Tab 2)，这些预测到的靶点蛋白经UniProt进行核对并统一。

2.3 成分-靶点网络结果与分析6个活性成分及其相对应的25个蛋白靶点，分别以节点、靶点输入到网络可视化软件CytoScape6.0中，得到C-T网络图(Fig 1)，有31个节点，47个边缘，其中六边形的节点表示6个活性成分，青色圆表示该成分对应的靶点。由Fig 1可以看出，靶点碳酸酐酶(carbonic anhydrase)亚型CA5A、CA7、CA3、CA5B、CA13在化合物十六酸甲酯和6,10,14-三甲基十五烷酮中均被预测到，脂氧合酶(lipoxygenase family)亚型ALOX12B、ALOX12、ALOX15、ALOXE3和ALOX15均在亚麻酸甲酯和9,12-十八碳二烯甲酯中作为共有的靶点蛋白。MBNL2和MBNL3对应于十六酸甲酯和棕榈酸中,大脑中的脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein)FABP7出现在亚麻酸、棕榈酸和9,12-十八碳二烯甲酯的交集中，过氧化物酶体增殖物激活受体-δ(peroxisome proliferator-activated receptor delta，PPARD)交集在亚麻酸、亚麻酸甲酯和9,12-十八碳二烯甲酯中。C-T网络表明，PPARD、PPARA、CA5A、CA7、CA3、CA5B、CA13、ALOX12B、ALOX12、ALOX15、ALOXE3是罗勒挥发油成分的主要作用靶点。将这些靶点信息利用DAVID数据库进行功能富集分析，选择P<0.01，结果显示这些预测靶点蛋白可能主要参与亚油酸代谢过程、脂氧合酶途径、花生四烯酸代谢过程、糖代谢过程、脂氧素A4生物合成过程、hepoxilin生物合成过程、建立皮肤屏障、细胞-基质黏附的正调节、伤口愈合、调节凋亡细胞的吞噬、适应性免疫反应的负调控、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路的调节、对白细胞介素-13的反应、磷脂酰乙醇胺生物合成等过程。

2.4 靶点-通路结果与分析预测到的48个靶点，通过整理和删除重复后，经TTD、KEEG等数据库获取其对应的疾病靶点及通路信息，经整理得到19个不同的作用通路(Tab 3)。结果显示，这些靶点主要是通过5-羟色胺突触(serotonergic synapse)信号通路、PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)、代谢途径信号通路(metabolic pathways)、花生四烯酸代谢信号通路(arachidonic acid metabolism)等信号通路。

Fig 1 Active components of basil and their corresponding targets(compound-target, C-T) network

The pink hexagon represents the six active ingredients in basil essential oil, and 25 cyan-blue circles represent the predicted target corresponding to the component.

Tab 3 Predicted signaling pathway based on active ingredient-target

将这些靶点与化学成分相互联系，用Cytoscape6.0构建成分-靶点-通路网络(compound-target-pathway)图(Fig 2)，这些靶点与信号通路还原到DAVID数据库中进行通路分析，选择P<0.05，结果预测靶点中描述的主要信号通路一致。

3 讨论

自从2007年 Hopkin提出网络药理学概念以来，网络药理学开始用于阐释中草药药效作用机制，突破了单个成分治疗单一疾病的局限。天然产物具有复杂的生物学活性，在中医药领域中，常用于疾病治疗，其独特的生物活性表现在中草药与生物体的作用特殊且较为复杂,进入人体后的作用途径与方式各有差异，有的直接作用于特定靶点，有的经代谢后产生新的产物，再作用于特定靶点, 还有的通过调控内源性物质间接发挥作用,或作用于不同的多个靶点，并发生协同作用等。

罗勒是在传统医学中应用历史悠久的药材之一，常用其干燥的全草和干燥的果实。近年来，随着罗勒水提物研究的不断深入，明确指出罗勒水提物有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗血栓等药理活性。临床上罗勒是治疗心脑血管疾病的首选药材之一。作为天然药物，罗勒化学成分多、药理作用复杂，用于疾病的作用机制尚未完全阐明。本文基于网络药理学，系统地阐述了罗勒挥发油中的活性成分，对活性成分预测出的蛋白靶点进行富集分析，结合信号通路描述了成分与作用靶点之间的直接联系。结果表明，罗勒挥发油成分中的亚油酸、亚麻酸甲酯、9,12-十八碳二烯甲酯等挥发油活性成分的作用靶点对应不同的信号通路，相互协调，共同调节，主要通过脂氧合酶(lipoxygenase family)亚型ALOX15、ALOX12、PTGS1、PPARD、PPARA等靶点，通过5-羟色胺突触信号通路、PPAR信号通路、代谢途径信号通路、花生四烯酸代谢信号通路等，共同作用于心血管疾病、神经性疾病等不同疾病，从不同角度揭示了活性成分的主要作用靶点和作用于疾病的主要途径。Magnusson等[13]通过实验验证了在缺氧状态下，心肌细胞、颈动脉斑块中ALOX15的表达均有增加。我们的研究结果表明，罗勒挥发油中活性成分可能通过花生四烯酸代谢途径作用于ALOX15，从而治疗缺血性心脏病、动脉粥样硬化等疾病。Levi等[14]研究结果表明，FABP5是乳腺癌细胞增长的关键因素。我们的研究结果表明，罗勒挥发油中的有效成分亚油酸能够与FABP5结合，从而通过PPAR信号通路作用于乳腺癌细胞的增殖。研究证明，亚油酸诱导乳腺上皮细胞中肌成束蛋白表达的增加，亚油酸通过癌细胞中的肌成束蛋白依赖途径，促进癌细胞的迁移、侵袭和MMP-9分泌[15]。本研究结果吻合了亚油酸抑制癌细胞的增殖、迁移和促进凋亡的实验结果，进一步可以从亚油酸是否通过FABP5与PPAR信号通路，来抑制肿瘤细胞的增殖与迁移的生物学验证进行研究。除了上述以外，这些成分靶点与信号通路可以用于治疗高脂蛋白血症、2型糖尿病、遗传性肥胖、早期婴儿型癫痫性脑病、抑郁症、先天性鱼鳞癣等皮肤病、神经系统障碍性疾病、心血管疾病、癌症、碳酸酐酶VA缺乏致高氨血症等疾病。通过对罗勒挥发油活性成分-多靶点-通路的网络药理学研究发现，罗勒挥发油中的多个活性成分作用于不同的靶点，经不同途径作用于多种疾病，呈现出天然产物的多成分、多靶点相互调节，发挥“异病同治”的特点。更能清楚地解释罗勒总提取物中的具体成分经某一靶点治疗疾病的作用机制，在药物研发中为药物成分的入选提供了佐证。

Fig 2 Essential active components of basil volatile oil-target-pathway

Purple hexagons indicate active ingredients of volatile oil, blue circles indicate component targets, and red triangles indicate signal pathways for the role of major targets.

本研究结果与先前研究的罗勒提取物的药理作用相吻合，说明预测靶点的准确性。此外，对于上述靶点以外的潜在靶点，相关文献研究报道较少，为今后对罗勒活性成分及其作用机制的研究提供了线索。