拉莫三嗪血药浓度检测方法构建与干扰因素研究

宋唤春 叶素红 王凯旋 仝淑花⋆

癫痫是最常见而严重的神经系统疾病之一，流行病学调查显示，我国现有＞900万癫痫患者，患病率达7‰，且以每年新发40～60万例的速度递增［1］。使用抗癫痫药物是主要的治疗方法，拉莫三嗪（LTG）作为第二代广谱抗癫痫药物，是复杂部分性发作的首选药物，对于特发性全面性癫痫丙戊酸治疗失败后的全身强直-阵挛发作，拉莫三嗪亦为首选药物［2］。LTG稳态时最高血药浓度个体差异性大，血药浓度易受其他合并用抗癫痫药物影响，皮疹发生率高且不能预测是否严重危害生命［3-6］。LTG血药浓度的监测利于优化LTG给药剂量实现个体化给药，并能有效避免不良反应发生。作者应用高效液相色谱检测LTG血药浓度，并对其影响因素进行分析。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱系统（G1322A在线脱气机，G1311C泵，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，G1315D DAD检测器和Chem32工作站）；电子天平（Mettler Toleto ML204/02）；超声波清洗机（JP-100/S 机械-数码）；离心机（xiang yi H-1650R）；氮吹仪（天津艾维欧PHC-010）。

1.2 药品与试剂 LTG对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：100775-200401）；非那西丁对照品（内标，IS，中国药品生物制品鉴定所，批号：100095-198904）； 乙 腈（Tedia. United states of America，AS1122-001，HPLC专用）；甲醇（国药集团化学试剂有限公司，批号20110415，HPLC专用）：甲酸铵、三乙胺、硫酸锌（分析纯）；水为超纯水并使用0.45μm滤膜再次过滤。40mM甲酸铵配制：称取甲酸铵1.00g加入400ml超纯水超声溶解，0.45μm滤膜抽滤备用；0.25%三乙胺配制：量取200ml超纯水，加入500μl三乙胺超声混匀备用；5%ZnSO4-MeOH溶液配制：称取1.00g ZnSO4加入20ml甲醇超声溶解，因静置24h便有沉淀析出，因此使用时需新鲜配制。

1.3 标准溶液配制 （1）LTG标准液配制：精密称取LTG对照品适量，置于25ml容量瓶中，用甲醇定容为500μg/ml储备液。将LTG储备液稀释成1，2.5，5，10，25，50，100，250，500 μg/ml质量浓度的标准液，储备液及标准液储存于4℃冰箱中。（2）内标溶液配制：精密称取非那西丁对照品适量，置于25ml容量瓶中，用甲醇定容为1mg/ml储备液，将非那西丁储备液稀释为100μg/ml内标标准液，储备液及标准液储存于4℃冰箱中。

1.4 LTG血药浓度检测方法的构建 （1）色谱条件：色谱柱：Agilent Exlipse XDB-C18（4.6×150mm，5μm）；柱温：25℃；流动相比例：40mM/L甲酸铵-乙腈-0.25%三乙胺（70：20：10，V/V）；流速：1ml/min；检测波长：0～8.5min 306nm（LTG）；8.5～12min 250nm（内标）。（2）血浆样本处理：精密吸取300μl血浆样品置10ml玻璃具塞试管中，加入30μl内标标准液，涡旋10s，加入300μl蛋白沉淀剂（5%ZnSO4-MeOH），涡旋30s，加入2ml萃取液（乙酸乙酯：正己烷=4：1），继续涡旋1min后，离心10min（4000r/min）后静置1min，取其上清液置10ml尖头玻璃离心管，水浴空气吹干30min，甲醇200μl复溶，用0.45μm针筒式微孔滤膜滤过，滤液置高效液相色谱样品瓶中，设置10μl进样。（3）标准曲线制备及最低定量限测定：吸取270μl空白血浆置10ml玻璃具塞试管中，分别加入不同浓度LTG标准液使总体积为30μl，涡旋10s，使血药浓度相当于0.1，0.25，0.5，2.5，1，5，10，25，50μg/ml的血浆标准液，以不同浓度LTG血药浓度峰面积As和内标峰面积Ai之比计算Y，以Y值为纵坐标，LTG浓度X为横坐标进行线性回归。（4）回收率测定：配制0.25，5，50μg/ml（低、中、高质控浓度）LTG血浆标准液测定；配制0.25，5，50μg/ml（低、中、高质控浓度）LTG甲醇标准溶液测定。血浆标准液与甲醇标准液峰面积比计算萃取回收率；将所测血浆标准液峰面积As和内标峰面积Ai之比代入标准曲线计算LTG血药浓度，以标准曲线计算值与加入值之比计算方法回收率。精密吸取300μl空白血浆置10ml玻璃具塞试管中，加入30μl内标标准液，测定记录峰面积；精密吸取300μl甲醇溶液加入30μl内标标准液测定记录峰面积。以血浆中内标峰面积与甲醇中内标峰面积之比计算内标提取回收率。（5）精密度测定：配制0.25，5，50μg/ml（低、中、高质控浓度）LTG血浆标准液各10份，1d内连续测定10次计算日内精密度；连续测定5d计算日间精密度。（6）稳定性测定：配制0.25，5，50μg/ml（低、中、高质控浓度）LTG血浆标准液，分为若干份，各浓度取1份处理后置进样器中，于0，1，6，12，24h进行检测，计算进样瓶内稳定性；各浓度取5份存于4℃冰箱中，于1，2，3，5，7d进行检测，计算冷藏稳定性；各浓度取6份存于-40℃冰箱中，于1，7，15，30，60，90 d进行检测，计算冻融稳定性。

1.5 血浆与全血中LTG浓度比较 抽取患者静脉血≥2ml置肝素试管送检（以下简称患者血样）。本试验将患者血样分为2份，一份涡旋混匀30s，取全血300μl待测，另一份离心10min（4000r/min）后取血浆300μl待测，两份样本处理后进行测定。

1.6 常见抗癫痫药物的干扰 将卡马西平、奥卡西平、苯妥英钠、丙戊酸钠、托吡酯、地西泮、氯硝西泮、三唑仑、艾司唑仑、咪达唑仑共10种抗癫痫药物加入到LTG血浆标准品中，处理后进行测定。

1.7 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。进行双侧配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 方法专属性与其他药物干扰 本方法色谱系统条件下，LTG和内标的保留时间分别约7.2min和10.8min，专属性实验表明LTG与内标峰分离良好，且不受血浆中内源性物质不影响，干扰性试验表明LTG测定亦不受卡马西平、奥卡西平、苯妥英钠、丙戊酸钠、托吡酯、地西泮、氯硝西泮、三唑仑、艾司唑仑、咪达唑仑等常见抗癫痫药物的影响，色谱图见图1。

图1 HPLC法测定LTG浓度色谱图

2.2 标准曲线及检测限 LTG在0.1～50μg/ml范围线性良好，直线回归方程为Y=0.01785218X-0.0078585，相关系数r=0.9996。LTG定量下限为0.1μg/ml。

2.3 回收率 见表1。

表1 LTG提取回收率与相对回收率

2.4 精密度 LTG日内日间精密度RSD均≤6.4%，见表2。

表2 LTG日内与日间精密度

2.5 稳定性 LTG血浆样本处理后置进样瓶内存放1日内检测RSD≤5.89；4℃冷藏1周内检测RSD≤6.14；-40℃保存3个月内冻融后检测RSD≤8.57，因此LTG样本在此三种储藏方式中均表现出良好的稳定性，可以满足临床样本的检测要求。

2.6 血浆与全血中LTG浓度比较 选取本院2015年4月份共20例患者血样同时进行血浆和全血中LTG浓度检测，测定结果经双侧配对t检验分析，配对t值为3.880，P值（双侧）＜0.01，血浆和全血中LTG浓度差值非0无统计学意义，因此同一血样血浆和全血中LTG浓度无差别。见表3。

表3 LTG血浆中浓度与全血中浓度比较（μg/ml）

2.7 临床应用 收入本院2015年4月份使用拉莫三嗪片日给药剂量为50～200 mg（符合拉莫三嗪片药品说明书用法用量要求）患者30例，24例患者血浆LTG浓度在1～8μg/ml有效浓度范围［4］内，分别有3例患者血浆LTG浓度＜1μg/ml和＞8μg/ml。3例血浆LTG浓度＞8μg/ml患者均联合使用丙戊酸钠缓释片，1例血浆LTG浓度＜1μg/ml患者合并使用卡马西平片，可见丙戊酸钠使LTG血浆浓度升高，而卡马西平使LTG血浆浓度下降，与文献［5，7-8］报道一致。服用不同日剂量拉莫三嗪片血浆LTG浓度分布情况。见表4。

表4 不同日剂量拉莫三嗪片血浆LTG浓度分布情况

3 讨论

本研究以乙腈和水作为流动相，加入甲酸铵、三乙胺有效改善色谱峰拖尾现象。流动相中三乙胺浓度轻微变化极易引起PH变动，影响色谱峰峰形，加入甲酸铵削弱了这种敏感性，配制流动相时不需要PH计精确测定，简化配制过程。参照张杰等［9］血浆中LTG浓度检测方法，采用非那西丁做为内标物质（非那西丁为市场淘汰药物），因不被患者所使用，不存在内标被干扰问题。LTG具有在190～250nm范围及310nm处有较大紫外吸收的特性，但在190～250nm处不仅血浆中有较多杂质具有紫外吸收较多常见并用药物（卡马西平、奥卡西平、苯妥英钠等）也有较强紫外吸收，本研究采用310nm紫外吸收波长检测LTG，250nm波长检测内标（非那西丁最大吸收），不受血浆杂质及其他合用抗癫痫药物影响。

本资料结果表明血浆和全血中LTG含量无差异方面存在漏洞，但提示在临床血浆样本量不足的情况下可以取全血进行LTG含量测定，也提示血浆样本存在溶血现象时不影响LTG含量测定。

本研究建立LTG血浆浓度检测法不受卡马西平、奥卡西平、苯妥英钠、丙戊酸钠、托吡酯、地西泮、氯硝西泮、三唑仑、艾司唑仑、咪达唑仑等常见抗癫痫药物的干扰。本研究LTG血浆浓度HPLC测定方法应用于临床血药浓度检测，与多篇关于拉莫三嗪血药浓度与疗效关系的报道所提出的参考血药浓度范围相一致［4-8］。