多靶位基因测序快速鉴定脓肿分枝杆菌复合群

刘永萍 刘雁 刘伟 沈瑶杰⋆

脓肿分枝杆菌复合群（MABC）属于快速生长型非结核分枝杆菌（NTM）可广泛引起人类致病［1］。MABC所引起的肺部感染等疾病症状与结核病非常相似，且MABC对一线抗结核药物天然耐药［2］。近年来，MABC引起人感染的报道越来越多，65%～80%的快速生长分枝杆菌（RGM）引起的NTM肺病主要是由 MABC感染导致的［3］。MABC主要是由脓肿分枝杆菌脓肿亚种（MAB），脓肿分枝杆菌马赛亚种（MMA）和脓肿分枝杆菌bolletii亚种（MBO）3个菌种组成的复合群［4］。MABC的三个亚种对较多NTM抗菌药物有不同的耐药谱。研究认为其临床致病特征及对抗生素的敏感度均存在差异［5］。因此，采用快速准确的进行MABC菌种鉴定明确区分三个亚种，对临床诊断和治疗有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 菌株标本为2012年1月至2015年12月杭州地区各结核病定点医院上送至杭州疾控结防所行药敏试验的固体罗氏培养阳性菌株，经对硝基苯甲酸/噻吩-羧酸酰肼（PNB/TCH）鉴别培养基培养鉴定为NTM的甘油保存菌株。结核分枝杆菌标准菌株（H37Rv ATCC27294）来自结防所实验室保藏，胞内分枝杆菌（ATCC13950）和脓肿分枝杆菌脓肿亚种（ATCC19977）购自美国ATCC公司，PNB/TCH鉴别培养基购自杭州创新生物有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit. Cat.No.51304）购自德国Qiagen公司，PCR试剂（TaKaRa Ex Taq Kit. Code No. RR001A） 及 DNA Marker（100 bp DNA Ladder.Code No. 3422A）购自日本Takara公司，PCR引物合成及其他PBS，乙醇，甘油，电泳缓冲液，溶菌酶，琼脂糖等常规试剂药品均购自上海生工生物公司。

1.2 实验方法 （1）分枝杆菌的培养及PNB/TCH表型鉴定：参照中国防痨协会《结核病诊断细菌学检验规程》［6］对来自杭州市基层结核病专科医院分离培养的分枝杆菌阳性菌株（即改良罗氏培养基上生长菌落）进行转接，接种环挑取少量菌体至加有1ml PBS的磨菌管中研磨并静置10min，取部分上清液转移至新的离心管中加入适量PBS稀释至0.5麦氏浊度。接着，用接种环沾一满环接种至PNB/TCH培养基及对照管（改良罗氏培养基），最后根据菌落生长情况及数量判断结果。（2）分枝杆菌基因组DNA提取：对PNB/TCH表型鉴定为NTM的菌株，挑取对照管罗氏培养基上生长的部分菌株转移至加有1ml PBS离心管中混匀，85℃ 30min水浴灭活处理。离心弃去上层液体后，加入现配的溶菌酶37℃裂解＞2h，并按照Qiagen公司细菌基因组DNA提取试剂盒说明书步骤操作提取NTM菌株的基因组DNA，最终用200μl TE缓冲液洗脱后-20℃保存。（3）靶基因扩增：参考沈瑶杰等［7］文献中16S rRNA、hsp65和rpoB三个基因的引物序列，合成引物并按其PCR反应体系和扩增程序分别扩增约1500 bp的16S rRNA，620 bp的hsp65和710 bp的rpoB基因。采用Primer premier 5软件设计分枝杆菌16S-23S rRNA基因间隔区ITS序列的扩增引物，MITS-F ：5'-TTGTACACACCGCCCGTCA-3'（位于16S rRNA 1390-1408nt），MITS-R ：5'-TCTCGATGCCAAGGCATCCACC-3'（ 位 于 23S rRNA 23-44nt）。 对PCR扩增产物取部分进行2%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增到目的基因条带。（4）序列测定及分析：经凝胶电泳检测合格的PCR产物直接送上海生工生物进行ABI 3730测序。序列经SeqMan软件与脓肿分枝杆菌标准菌株（ATCC19977）的16S rRNA基因584bp，hsp65基因441bp，rpoB基因360bp的标准序列进行比对并截取得到完整的各基因序列，将每条序列进行在线BLAST比对分析以确定相应菌株的菌种类型。（5）准确鉴定：对hsp65和rpoB测序结果不一致的菌株再加入ITS序列作为第4个靶基因进一步进行菌种鉴定。对编辑后的每一菌株的三个基因片段的准确序列进行串联拼接得到16S rRNA +hsp65+rpoB的1385 bp基因序列，采用MEGA 5.0软件的Neighbor-Joining法，以各标准菌株参考序列作为参照进行同源聚类分析，将亲缘关系相近或成簇分布的菌株确定为同一类型菌种。

2 结果

2.1 PNB/TCH表型鉴定 参照中国防痨协会《结核病诊断细菌学检验规程》的判定规则，即在改良罗氏、对硝基苯甲酸、噻吩-羧酸酰肼鉴别培养基上均生长的为非结核分枝杆菌，在改良罗氏L-J、噻吩-羧酸酰肼鉴别培养基上生长而在硝基苯甲酸培养基上不生长的为结核分枝杆菌，对临床分离菌株常规进行PNB/TCH的表型鉴别，作为分枝杆菌菌种的初步鉴定。

2.2 靶基因序列在线BLAST比对分析结果 将获得的PCR产物序列经BioEdit软件查看序列峰图，检查测序结果是否合格，并用DNAstar SeqMan软件与脓肿分枝杆菌脓肿亚种（ATCC19977）对应的靶基因（16S rRNA基因584 bp，hsp65基因441 bp和rpoB基因360 bp）的参考序列进行比对、剪切并保存所需片段的目的序列*.seq文档。将每个样品每个目的基因的准确序列提交至NCBI在线作同源性比对分析（见表1）。16S rRNA基因584 bp序列的BLAST比对分析发现52株MABC的同源性高达100 %。hsp65基因441 bp的BLSAT比对分析结果发现这52株MABC中有41株为MAB，9株为MMA以及2株MBO。rpoB基因360 bp的BLSAT比对分析结果则是44株MAB，6株MMA和2株MBO。两个靶基因的测序结果中有5株MABC的鉴定结果是不一致的，编号为N02的菌株，hsp65和rpoB两个基因的测序结果分别是MAB和MMA；编号为N39、N46、N47和N51这4个菌株，hsp6基因的测序结果是MMA，而rpoB基因的测序结果则均是MAB。对hsp65和rpoB两个靶基因测序结果不一致的5个菌株进一步扩增ITS序列进行鉴定，比对分析结果均是MMA。故52株MABC的准确鉴定结果是40株MAB，10株MMA和2株MBO。

表1 52株MABC的表型及16S rRNA、hsp65、rpoB 和ITS测序鉴定结果

2.3 串联序列的同源聚类分析结果 从GenBank下载各分枝杆菌标准株对应靶基因的参考序列，包括结核分枝杆菌标准株（H37Rv ATCC27294）、胞内分枝杆菌（ATCC13950）、龟分枝杆菌（CIP104535）、脓肿分枝杆菌脓肿亚种（ATCC19977），脓肿分枝杆菌马赛亚种（CIP108297），脓肿分枝杆菌 bolletii 亚种（CIP108541）。用MEGA 7.0软件对靶基因16S rRNA、hsp65和rpoB的准确基因序列进行编辑、比对和校正，进一步采用Neighbor-Joining法对16S rRNA +hsp65+rpoB三个基因片段的串联序列作系统进化树分析，通过目的序列与标准参考序列的聚类分析确定脓肿分枝杆菌复合群各亚种的准确序列，实现亲缘关系十分相近的NTM复合群及其亚种的准确鉴定。实验菌株序列与标准菌株序列聚类成一簇的菌株被确定为该标准菌株的同一菌种，最后将52株MABC鉴定为40株MAB，10株MMA及2株MBO，结果与表1的准确鉴定结果一致。

3 讨论

分枝杆菌属包括结核分枝杆菌复合群（MTBC），麻风分枝杆菌及190多种NTM及其亚种［2］。NTM广泛存在于自然界中，因其种类繁多，多为腐物寄生菌，仅少部分对人体致病且发病率较低，以往较少受到研究者的重视。MABC是可引起人类致病的重要非结核分枝杆菌，临床分离NTM菌株中，MABC也是分离率最高耐药性最强的RGM［7］。

传统菌种鉴定方法耗时又费力且准确性差还不能鉴定到种，同时依赖于专业技术人员的观察进行可靠结果的判定。近年来，基于分子生物学的菌种鉴定方法得到广泛开展，提高细菌菌种鉴定的水平。PCR测序技术的迅速发展，对16S rRNA基因测序分析可将常规细菌鉴定至种的水平，现已成为鉴定菌种的金标准。同样，分枝杆菌属菌种鉴定中PCR测序的效果明显优于传统生化鉴定，但16S rRNA基因测序鉴定的方法对高度同源的NTM菌种而言其鉴别能力有限，只能准确鉴定部分NTM至种的水平，对类似MABC等NTM中的复合群是无法进行准确区分的。本研究对PNB/TCH表型鉴定为NTM的菌种进行16S rRNA基因测序分析，可以将NTM初步鉴定至种的水平。对52株NTM，16S rRNA序列比对分析仅能将其鉴定为MABC，通过DNAstar软件对序列分析发现52株脓肿分枝杆菌复合群的16S rRNA基因的序列同源性高达100 %，符合文献报道的16S rRNA基因在分枝杆菌属不同菌种间序列相似性为94.3%～100%［8］，即MABC的16S rRNA基因测序结果是完全一致的，故16S rRNA基因的测序分析无法进一步将MABC鉴定至亚种的水平。

用于菌种鉴定的靶基因既要求在不同的菌种间具有较高的序列保守性，可实现通用引物对不同菌种目标序列的扩增，又要求不同菌种的同源序列具有一定水平的差异，以实现鉴别区分的目的。综合文献报道，目前对于NTM的菌种鉴定常用的靶基因除了16S rRNA基因外主要还包括16S-23S rRNA基因间隔区（ITS）、RNA聚合酶β亚基（RNA polymerase subunit，rpoB）、热休克蛋白 65（hot shock protein 65，hsp65）和DNA解旋酶（gyrA/gyrB）的编码基因及sodA、recA等基因。仅就鉴别能力，hsp65优于rpoB和ITS，16S rRNA基因的鉴别能力最低［9-10］。本研究在16S rRNA基因基础上选取了hsp65和rpoB两个靶基因分别对52株MABC进行进一步亚种鉴定，每个基因的BLAST比对结果虽然都能将MABC鉴定至亚种，但两个基因的鉴定结果有9.6 %（5/52）的菌株不一致，进一步加测靶基因ITS序列的结果为MMA，故将这些不一致的菌株均确定为MMA。hsp65基因和rpoB基因虽已被主要用于鉴定MABC，但本研究发现这两个基因在鉴别同源性非常近的MABC亚种时也是存在各自的局限性。因此单一的靶基因测序分析由于分辨能力不足无法将MABC等亲缘关系相近的分枝杆菌或者复合群的亚种准确鉴别。

目前多采用多靶位基因测序［11］，将测序结果比对分析并相互验证或将多个靶基因序列进行串联并作聚类分析作为鉴定MABC的有效方法。对于多靶位基因测序鉴定结果不一致的现象，可通过增加多个靶基因，取多数基因鉴定一致的结果作为最终的准确鉴定结果。本研究通过串联16S rRNA基因、hsp65和rpoB三个靶位基因的准确序列进行同源聚类分析，获得的结果与16S rRNA基因、hsp65、rpoB和ITS四个靶基因测序的联合分析鉴定结果一致。因此，在实际临床检验中对分枝杆菌的鉴定，PNB/TCH表型鉴定为NTM的菌株经16S rRNA基因测序发现为MABC的菌种可以进一步加测hsp65和rpoB甚至是ITS，进行多基因联合分析鉴定，实现MABC亚种的快速、准确鉴定，必将有助于NTM肺病的精准诊断与治疗。