酸雨胁迫下接种土壤微生物对栾树幼苗生长的影响

陈璐璐，雷妮娅

北京林业大学林学院，北京 100083

随着工业的不断发展，酸雨现象在全球范围内蔓延且不断加重。在中国，酸雨现象同样日趋严重，华北地区酸雨危害面积不断扩大（俞飞等，2016），致使该地区植物及生态系统面临巨大挑战。酸雨阻碍植物光合作用（蔡梦莎，2012），影响植物生物量积累（张海艳，2013；梁晓琴，2013；Ramlall et al.，2015），严重危害植物生长表现，植物幼苗生长阶段极易受到酸雨的不良胁迫，森林群落物种更新也受到酸雨影响。森林生态系统中土壤微生物对酸雨的响应相当敏感，它们的变化致使土壤养分发生变化并直接或间接影响植物的生长状态。酸雨引起土壤酸化并破坏土壤结构，改变土壤微环境，从而影响微生物活动及土壤酶的活性，对土壤生态平衡产生不良影响（王琳等，2014）；土壤微生物中有益微生物类群与植物生长密切相关，尤其是与植物互利共生的菌根真菌群落（梁倩倩等，2014），它们对酸雨的响应可较大程度地影响植物的生长。植物根系菌根真菌对酸雨的响应主要体现在其群落结构、定殖率及在根系内的形态结构等方面的变化，并进一步出现养分吸收及运输等功能性方面的改变（吕超群等，2007）。根系菌根真菌帮助植物应对酸雨胁迫的积极作用，主要表现在增强对植物根系的物理保护（Courty et al.，2010），提高其养分吸收能力（如N、P、K等）（Christophe et al.，2010）以及相关酶活性（Baghel et al.，2009）等方面。其中，关于泡囊-丛枝菌根真菌（Vescile-Arbusular Mycorrhizal Fungi，VA）的研究相对成熟，它们在植物养分吸收与运输过程中的作用及对生态系统群落构建及演替过程的影响都得到了深入研究，相关研究成果也得到了广泛应用（韦莉莉等，2016；蒋胜竞等，2014）；目前，探索VA在植物应对逆境胁迫中的积极作用方面的研究为数众多，确认了VA能缓解逆境胁迫给植物造成的各种不良影响，诸如生物量积累降低、养分失衡、种子败育或萌发率低下等（Zhao et al.，2015；Kongpun et al.，2011）。各种逆境胁迫中，酸雨胁迫因其危害范围广、程度深、持续时间久等特点而受到了重视，但是具体到不同酸雨胁迫梯度对根系真菌形态、结构及功能的影响报道较少。本研究将结合植物生物量及叶片氮磷含量等重要指标，研究酸雨胁迫下接种土壤微生物对植物根系泡囊-丛枝菌根真菌定殖情况、形态结构及由此对植物生物量积累及养分吸收情况产生的影响，并试图证明泡囊-丛枝菌根真菌在调节植物应对酸雨胁迫中的重要作用。

目前大多数关于菌根真菌促生作用的接种试验多采用单一菌株或几种菌株混合作为接种剂，以栾树（Koelreuteria paniculata）根际土壤作为微生物接种剂，可较全面地接种其根际土壤微生物群，更精确地模拟野外根际微生物环境。栾树属无患子科栾树属乔木树种，是中国华北地区重要的森林群落树种及城市行道树种、观赏树种，性喜石灰质（碱性）土壤，在硅基酸质的红土地区不能生长，对酸雨相当敏感；其幼苗阶段是对逆境胁迫最为敏感的时期。因此，以栾树幼苗作为受试植物材料，通过土壤微生物接种处理及模拟酸雨胁迫处理，开展栽培试验，试图探讨以下两个问题：（1）酸雨胁迫对栾树根系泡囊-丛枝菌根结构特性及定殖率的影响；（2）酸雨胁迫如何通过影响泡囊-丛枝菌根真菌对栾树幼苗生长及养分吸收产生影响。本研究旨在进一步完善泡囊-丛枝菌根真菌在植物抗逆境胁迫方面的相关理论研究，评估栾树的抗酸雨能力及探索根系泡囊-丛枝菌根真菌在植物抗酸雨方面的相关缓解机制，为今后制定保育措施提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从中国林木种子公司购买北京乡土栾树种子，用多菌灵试剂灭菌并经无菌水清洗干净后装入塑料袋内进行低温（4 ℃）催芽，待种子破壳播种于无菌育苗盘中统一育苗，2个月后挑选长势整齐的幼苗移栽到育苗基质与土壤接种剂按一定比例混合的塑料盆中，并开展试验。本试验中育苗基质均为无菌草炭土：蛭石：珍珠岩（2∶1∶1，体积比）混合物，3种成分均经灭菌处理。土壤接种剂为采自北京市鹫峰林场栾树林的野生成年栾树根际土壤。将采集的根际土壤分为两份制成接种剂，其中一份原状低温保存，另一份经高压真空灭菌处理，121 ℃湿热灭菌45 min，连续2次，24 h后重复（Nie et al.，2013）。分别将两种接种剂（灭菌土、不灭菌土）混匀于育苗基质中，使育苗基质中接种剂体积比为 5%（Lau et al.，2011；McNamara et al.，2003），采集到的栾树根际土壤pH值为5.75，有机质、全氮、全磷含量分别为 18.19%、3.06 g·kg-1、1.02 g·kg-1，微生物生物量碳、氮含量分别为 285.9 mg·kg-1和 37.4 mg·kg-1，无菌草炭土 pH 值为 7.18。

1.2 盆栽试验设计

盆栽试验在北京林业大学八家苗圃内的简易塑料棚中开展。试验采用双因素随机试验设计，设置了 3个酸雨强度梯度（pH1=3.5，pH2=4.5，pH3=5.6）及2种接种方式（灭菌土和不灭菌土），共6个处理，各处理重复5次。中国酸雨类型主要为硫酸型，故酸雨母液采用体积比为 5∶1 的H2SO4∶HNO3的混合液，每次使用时取适量酸雨母液利用手持便携式pH计配制酸雨液。试验于2015年4月3日开始，于8月27日收获所有苗木，期间每隔3天进行1次酸雨喷施，具体喷施时间为上午 8：00－8：30；喷施量参考北京市近 5 年（2010－2014年）4－8月月均降水量（见表1）。酸雨仅喷洒在土壤中，严格避免喷施液接触到植物地上部分。试验过程中酸雨配置用水及常规水分管理浇灌用水均为去离子水。

表1 2010－2014北京市4－8月平均降雨量及试验中酸雨浇灌量Table 1 Precipitation of Beijing from April to August between 2010 and 2014 and the monthly irrigation amount of simulated acid rain in test

1.3 指标测定

于收获日对栾树幼苗进行基径、株高及生物量进行测量，基径使用50 mm游标卡尺测量，株高使用20 cm直尺直接测量，植株于65 ℃下烘干后测生物量（干质量）。根系内生真菌侵染率测定方法：在对细根进行取样烘干处理之前每个样品留取 0.2 g乳白色根端，切成约1 cm的根段，清洗干净后用福尔马林-酒精-醋酸混合固定液（FAA，体积分数为50%的乙醇、甲醛水、冰醋酸的体积比为90∶5∶5）固定保存，加入5 mL甘油可长期固定（张春英，2008），用于丛枝菌根菌侵染率测定。丛枝菌根菌侵染率测定参考Phillips et al.（1970）的方法。从固定液中取出根段样本并放入 10%氢氧化钾溶液中，90 ℃水浴加热1.5 h至根系透明；洗去碱液后用体积分数为10%的H2O2漂白15 min；清洗干净并用0.2 mol·L-1的盐酸酸化1 h；酸化根段用台盼蓝染色15 min后用乳酸酚脱色30 min；最后将脱色处理过的根段清洗干净后压片进行显微镜镜检。每株幼苗随机取10条根段，每个处理取100条根段进行镜检。镜检采用十字交叉法计数（Mcgonigle et al.，1990）。对视野内被十字丝所搭上的菌丝、泡囊和丛枝结构分别进行计数并记录在同一个交叉点下，通过等距移动玻片使每组根段形成不少于150个观察视野，同时对幼苗的泡囊-丛枝菌根真菌结构特征进行观察，并使用佳能PC1591进行拍摄记录。侵染率计算公式为：泡囊侵染率=(泡囊侵染的交叉点数和/总交叉数)×100%，菌丝侵染率=(菌丝侵染的交叉点数和/总交叉数)×100%，总侵染率=(总交叉点-无侵染点数)/总交叉点×100%（Mcgonigle et al.，1990）。

土壤pH利用pH计（OHRUS，STARTER2100）测定（土∶水=1∶5，质量体积比）。土壤有机碳测定采用重铬酸钾-浓硫酸外加热法（Nelson et al.，1982）。微生物生物量碳氮采用氯仿熏蒸法（Vance et al.，1987）。土壤全氮全磷、叶片氮磷含量测定采用催化剂消煮法，使用 AA3连续流动分析仪（AutoAnalyzer 3）测定消煮液中氮磷含量，其中叶片消煮液稀释5倍后上AA3连续流动分析仪测定叶片氮磷含量（丁凡等，2011）。菌根依赖度(Mycorrhizae Dependence, MD)=(接种处理植物干物质-非物质处理物质干物质)/接种处理植物干物质×100%（Klironomos，2002）。

1.4 数据处理与分析

在Excel中对所有数据进行基础处理，对不符合正态分布的数据进行LOG或SQRT转换，运用SPSS 17.0对不同酸雨处理下的菌根结构侵染率、生长及生理指标进行单因素方差分析（One-way ANOVA），比较不同酸雨或接种方式对供试幼苗指标作用的差异性是否显著；以接种方式和酸雨梯度为固定因子对内生菌侵染率，栾树生长指标及叶片氮磷、氮磷比率进行双因素方差分析（Two-way ANOVA）及Duncan多重比较，对试验中不同酸雨梯度处理中栾树幼苗总生物量，地上生物量，地下生物量，根冠比，株高，基径，叶片氮、磷及氮磷比，根系内生菌总侵染率进行相关性分析（Pearson correlation analysis）。

2 结果与分析

2.1 不同酸雨梯度下栾树根系内生真菌侵染特征

通过显微镜观测并记录泡囊-丛枝菌根真菌各结构形态特征及侵染率。泡囊-丛枝菌根真菌的典型结构（泡囊、丛枝、菌丝）在3种酸雨强度梯度处理中均有出现，丛枝结构在各处理中多呈现消解状态且数量较少，本文将丛枝结构侵染记录为菌丝侵染。栾树幼苗根系泡囊-丛枝菌根真菌各结构特征见图1。

栾树幼苗根系泡囊-丛枝菌根真菌各结构定殖情况，在不同强度酸雨胁迫下存在显著差异（表2）。菌丝和泡囊两种结构的侵染率及菌根真菌总侵染率3项指标随着pH值的升高而下降，pH 3.5处理下菌丝侵染率、泡囊侵染率及总侵染率分别是 pH 5.6处理下的2.4、2.2、2.2倍，pH 4.5处理下该3项指标分别是pH 5.6处理下的1.5、1.4、1.6倍。本研究中不接种处理的栾树幼苗根系菌根各结构侵染极低，甚至为0，因此下文不予分析。

表2 不同酸雨梯度栾树幼苗根系泡囊-丛枝菌根结构侵染率Table 2 Vesicle-arbuscular mycorrhizal fungi colonization ratio of Koelreuteria paniculata seedlings under acid stress

图1 栾树根系泡囊-丛枝菌根结构特征Fig. 1 Vesicle-arbuscular mycorrhizal fungi structure traits of Koelreuteria paniculata

2.2 不同处理下栾树幼苗生长情况分析

从双因素方差分析结果看（表3），酸雨胁迫与土壤接种处理及其交互作用均对栾树幼苗基径、地上生物量及地下生物量有显著影响，两者交互作用均对栾树幼苗各生长指标具有显著影响（P＜0.05）；但是，酸雨胁迫、接种处理及其交互作用对栾树幼苗根冠比均不具有显著影响。总体上，pH 3.5处理下（接种及不接种土壤微生物）栾树幼苗各生长指标高于其他两种酸梯度处理，且接种土壤微生物下，pH 3.5处理下栾树幼苗基径、株高、地上及地下生物量均显著高于 pH 4.5及 pH 5.6处理（P＜0.05），而pH 4.5及pH 5.6处理间各指标差异性不显著（P＞0.05）。pH 3.5处理下接种土壤微生物处理的栾树幼苗基径、株高、地上及地下生物量均显著高于未接种处理（P＜0.05），分别较其高出30%、45.9%、121.6%、114.5%；pH4.5处理下，接种处理的栾树幼苗地上、地下生物量均显著高于未接种处理（P＜0.05），分别较其高出 52%、76.7%。pH 5.6处理下，接种处理的栾树幼苗株高显著低于未接种处理（38.5%，P＜0.05），接种处理的幼苗基径、地上及地下生物量高于未接种处理，但不显著（P＞0.05）。以上结果表明，pH 3.5和pH 4.5处理下，接种土壤微生物处理对栾树幼苗生长有较大的促进作用，而pH 5.6处理下，接种土壤微生物处理对栾树幼苗生长的促进作用稍弱些。另一方面，从菌根依赖度（MD）（表3）可知，pH 3.5处理下，栾树幼苗对根系菌根真菌的依赖度最高，其次是pH 4.5，pH 5.6处理下栾树幼苗对菌根真菌的依赖性最低。

接种方式显著影响栾树幼苗叶片氮含量及氮磷比率，酸雨胁迫及其与接种处理的交互作用对幼苗叶片氮磷含量及氮磷比率不具有显著影响（表4）。3种 pH梯度下，未接种处理栾树叶片氮含量及氮磷比率均显著高于接种处理（P＜0.05）；未接种处理栾树叶片磷含量略高于接种处理（P＞0.05）。不同酸雨梯度下，接种土壤微生物并未促进栾树幼苗叶片氮磷含量的积累，反而降低了栾树幼苗叶片的氮含量，叶片氮磷比受到显著影响。

2.3 栾树幼苗生长指标与根系内生真菌侵染率相关性分析

对接种处理下3种酸雨处理栾树幼苗生长指标与根系泡囊-丛枝菌根真菌总侵染率进行Pearson相关性分析，结果（表5）表明，pH 3.5处理下，栾树幼苗根系菌根真菌侵染率与总生物量、地上生物量、地下生物量、基径有极显著正相关关系（P＜0.01），与株高有显著正相关关系（P＜0.05），与叶片氮有极显著负相关关系（P＜0.01）；pH 4.5处理下，栾树幼苗根系菌根真菌真菌侵染率与总生物量、地上生物量、地下生物量有极显著正相关关系（P＜0.01），与株高、叶片氮和叶片氮磷比有显著负相关（P＜0.05）；pH 5.6处理下，栾树幼苗根系菌根真菌侵染率与各生长指标无显著相关关系（P＞0.05）。以上结果表明，不同酸雨梯度下，幼苗根系菌根真菌侵染率与幼苗生长指标之间的相关关系存在较大差异。

表3 各处理下栾树幼苗生长情况Table 3 Growth condition of Koelreuteria paniculata in different treatments

表4 各处理下栾树幼苗叶片氮、磷含量及氮磷比率Table 4 Leaf N, P and N：P ratio of Koelreuteria paniculata in treatments

表5 不同酸雨梯度下栾树幼苗生长指标与根系泡囊-丛枝菌根真菌总侵染率的相关关系Table 5 Correlation analysis of seedling growth index and vesicle-arbuscular mycorrhizal fungi colonization ratio under acid stress gradients

2.4 各处理下土壤养分状况分析

由表6可知，酸雨梯度、接种方式均对土壤pH有极显著影响（P＜0.001），且两者间有极显著的交互作用（P＜0.001）；酸雨梯度对土壤有机碳无显著影响（P＞0.05），而接种方式对其有极显著影响（P＜0.001），两者对土壤有机碳无显著交互作用（P＞0.05）；酸雨梯度、接种方式对土壤全氮有极显著影响（P＜0.001），而两者间无显著交互作用（P＞0.05）；酸雨梯度对土壤全磷有极显著影响（P＜0.001），接种方式对全磷无显著影响（P＞0.05），且两者间无显著交互作用（P＞0.05）。除pH 4.5不接种处理下pH值显著低于其他处理外，各处理间pH值差异性不显著（P＞0.05），但总体上强酸处理下pH值低于其他酸雨强度处理。pH 3.5和pH 4.5处理下接种土壤微生物处理有机碳含量显著低于不接种处理；pH 4.5处理下接种土壤微生物处理土壤全氮含量显著低于其他处理；pH 4.5处理下接种土壤微生物处理及 pH 5.6处理下不接种处理土壤全磷含量显著低于其他处理。

3 讨论

3.1 栾树根系泡囊-丛枝菌根真菌在酸胁迫环境中的适应性表现

研究表明，酸雨会导致植物形成菌根的能力下降且改变菌根共生体的结构特征（梁倩倩等，2014；吕超群等，2007）。本研究表明，酸雨胁迫促进了菌根真菌的定殖，并影响其结构及形态的形成。强酸性酸雨淋洗有利于菌根真菌真菌泡囊结构、菌丝结构的形成，泡囊-丛枝菌根真菌菌丝及泡囊结构在强酸胁迫（pH 3.5及pH 4.5）下有较高的定殖率，表明强酸胁迫环境激发了根系菌根真菌的定殖，可能增加胁迫环境下幼苗根系养分吸收的途径及能力；而冯曾威等（2017）的研究结果与本研究略有差异，其通过调节土壤的 pH值，表明低土壤 pH（3.7）会抑制丛枝菌根真菌菌丝及丛枝结构的形成。本文中强酸雨的淋洗却更有利于栾树幼苗根系菌根真菌的定殖，可能的原因是，经过一个生长季的淋洗后，pH 3.5处理下盆栽土pH为6.82，pH 4.5处理下为6.90，pH 5.6处理下为7.06，而泡囊-丛枝菌根真菌是一类喜酸性的真菌类群，具有嗜酸性的特征，能忍耐较低pH的环境（Vosatka et al.，1998），在偏酸性环境下定殖发育良好。不同酸雨梯度处理下，随着土壤有机碳的增加，幼苗根系菌根真菌侵染率降低，有研究表明不少丛枝菌根真菌物种随着土壤基质有机质含量的升高侵染率及菌丝量均下降（张旭红，2003），其中的作用机理有待进一步研究。而Vosatka（1999）认为酸雨模拟试验中泡囊-丛枝菌根真菌定殖率的积极响应有可能与酸雨溶液中的氮、硫元素的养分滋养效益有关。目前关于模拟酸雨或土壤pH调控影响根系菌根真菌形态及结构的相关研究报道不多，今后开展该方面的研究有利于进一步明确菌根真菌对酸雨胁迫的耐受强度及其对植物生长及养分吸收产生影响的主要表现形式及影响机制。

表6 各处理下土壤部分理化性质情况Table 6 pH value, SOC, TN, TP content of soil in different treatments

3.2 不同酸雨梯度处理下栾树生长差异的菌根真菌生物学机制探讨

接种土壤微生物处理对幼苗生长的促进效益在不同酸雨梯度下存在较大的差异：从生物量积累、横纵向生长情况来看，在强酸性处理中（pH 3.5和pH 4.5处理），促进效益显著；而在弱酸处理中（pH 5.6），效益并不显著，且栾树幼苗在强酸处理中（pH 3.5和pH 4.5处理）有较高的菌根真菌依赖度（MD）。由此可知，强酸雨胁迫环境下，栾树幼苗生长较大程度地依赖根系内有益真菌（泡囊-丛枝菌根真菌），表明在强酸逆境胁迫中共生真菌对栾树幼苗生长有重要的有益调节作用，推测此为根系共生真菌帮助植物抵抗酸胁迫逆境表现出的一种适应性策略。泡囊-丛枝菌根真菌帮助植物抵抗逆境及促进植物生长的机制已经比较清楚，它们通过活化土壤中的难溶有机物，吸收养分并将其运输至宿主植物，而它们的泡囊结构也具有储藏磷脂的功能，可在逆境中加强养分元素的分解及释放，供植物利用（刘润进等，2007）。相关性分析结果显示不同酸强度淋洗下菌根真菌总侵染率与幼苗生长指标间的相关关系差异较大，说明泡囊-丛枝菌根真菌与幼苗生长指标之间的关系显著受到环境酸性程度的影响。强酸胁迫可能激发菌根真菌对栾树幼苗的促生长作用，提高植物的耐酸性（张爽等，2014；Kongpun et al.，2011；刘润进等，2017）。而从不同处理下栾树幼苗叶片氮、磷含量来看，接种土壤微生物不利于各酸雨强度下幼苗对养分的吸收或积累，并且相关性分析结果显示幼苗根系内生真菌总侵染率与叶片氮存在负相关关系，尤其在强酸性处理中表现为显著负相关；于浩等（2017）以马尾松幼苗为受试材料的研究结果表明：pH 3.5及pH 4.5强酸雨胁迫下，接种菌根真菌处理的叶片氮、磷含量低于未接种处理；另赵昕等（2006）研究表明丛枝菌根真菌并未对寄主植物叶片氮、磷养分吸收产生促进作用且减少了对地上部分叶片氮、磷比例的分配，相反，接种丛枝菌根增加了根系氮、磷养分的分配，针对这一现象中根系菌根真菌的作用机制未深入探讨，推测在强酸雨胁迫条件下，菌根真菌可能优先满足自身养分吸收及地下根系养分吸收，而后向远端（地上部分）分配。此外，毕银丽等（2014）通过接种不同微生物研究其对大豆幼苗生长的试验表明，单独接种泡囊-丛枝菌根真菌时，叶片氮、磷含量高于未接种处理，而同时接种其他微生物类群，如解磷菌、根瘤菌等时，接种处理的叶片氮、磷含量低于未接种处理，因此，我们推测泡囊-丛枝菌根真菌与其他土壤微生物之间存在某种拮抗作用，影响幼苗矿质养分的吸收；在今后的研究中，应针对供试物种、试验方法、酸胁迫梯度及不同微生物类群等因素对根系内生真菌促生效益的影响强度差异性进行更深入的研究与探讨。

4 结论

本文在一定程度上阐明了接种土壤微生物对栾树幼苗抵抗酸雨的作用，重点研究了泡囊-丛枝菌根真菌结构特征和侵染率的特征及其与植物生长的关系。得出以下结论：（1）强酸雨胁迫（pH 3.5及pH 4.5）促进了栾树幼苗根系泡囊-丛枝菌根真菌泡囊结构和菌丝结构的定殖；泡囊-丛枝菌根真菌结构在酸胁迫下的该种表现形式是对酸雨胁迫的重要适应策略。（2）结合强酸胁迫下根系真菌定殖情况与幼苗生物量相关关系可知，根系泡囊-丛枝真菌对栾树幼苗生长有促进作用；栾树幼苗在强酸处理中有较高的菌根依赖度，表明根系菌根真菌定殖率提高是栾树幼苗抵抗酸雨的重要策略。