鲍曼不动杆菌荚膜厚度对鼠巨噬细胞炎症复合体活化的影响

吴亮，陆娟，2，王廷廷，万晟霞，邹治情，戴晓玥，夏雯，阴晴，陈盛霞，许化溪

（1.江苏大学医学院，江苏 镇江212013；2.江南大学附属医院检验科，江苏 无锡214062；3.江苏大学第四附属医院神经内科，江苏 镇江212001；4.江苏大学附属医院检验科，江苏 镇江212001）

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，A.baumannii）是重要的机会致病菌，广泛定植于人类皮肤、胃肠道、上呼吸道中，可引起各种医院内获得性感染，如肺炎、尿路感染、菌血症和脑膜炎等。近年来鲍曼不动杆菌临床分离率逐年升高，已成为主要的医院内感染病原体［1］。鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类、喹诺酮类和β-内酰胺类抗生素的大范围耐药，特别是对碳青霉烯类抗生素耐药，给临床治疗提出了严峻挑战［2］。

鲍曼不动杆菌侵袭宿主细胞过程中可以导致细胞严重损伤，但其确切机制仍不清楚。目前的研究多集中于其较强耐药性和顽强生存能力，却较少涉及致病机制及毒力因子［3］。鲍曼不动杆菌有多种毒力因子，包括外膜蛋白、内毒素、磷脂酶和荚膜等。荚膜是细菌经典毒力因子，在细菌致病过程中发挥重要作用［4］。研究表明，细菌荚膜成分可以激活人体固有免疫细胞内重要的多蛋白复合物——炎症复合体，使细胞感知病原微生物的侵入并启动免疫防御功能，杀伤、清除病原微生物或产生免疫损伤反应。但目前尚缺乏鲍曼不动杆菌激活炎症复合体的研究［5］。本研究通过比较两株荚膜厚度显著不同的鲍曼不动杆菌对鼠巨噬细胞炎症复合体激活能力的差异，探讨鲍曼不动杆菌荚膜在细菌激活固有免疫细胞及其致病中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

鲍曼不动杆菌分离于江苏大学附属医院的患者痰液中，纯化后冻存于15%脱脂牛奶中备用；鼠巨噬细胞（Raw 264.7）购自上海中科院细胞库；哥伦比亚琼脂培养基购自青岛海博生物技术有限公司；羊血购自贝瑞特生物公司；刚果红染料购自上海生工生物有限公司；结晶紫染液购自北京索莱宝生物公司；RPMI 1640培养基为HyClone（北京）有限公司产品；胎牛血清和胰蛋白酶（1∶250）为美国Gibco公司产品；细胞总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒（SYBR Green染料法）均购自南京Vazyme公司；活性氧检测试剂盒（DCFHDA荧光探针法）购自碧云天公司。

PCR引物由苏州泓迅生物公司合成，各引物序列如下，NLRP3上游：5′-AACAGCCACCTCACTTCCAG-3′，下游：5′-CCAACCACAATCTCCGAATG-3′；Caspase-1上游：5′-GCACAAGACCTCTGACAGCA-3′，下游：5′-TTGGGCAGTTCTTGGTATTC-3′；IL-1β 上游：5′-CCTGTCCTGCGTGTTGAAAGA-3′，下游：5′-GGGAACTGGGCAGACTCAAA-3′；GAPDH 上游：5′-TCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游：5′-ACTCCACGACATACTCAGC-3′。

1.2 细菌荚膜的刚果红法染色

细菌荚膜的染色根据王怀兵等［6］报道的刚果红染色方法并加以改进。将4%的刚果红染液与胎牛血清按4∶1混匀，取1滴滴加于玻片上，挑取适量对数生长期的鲍曼不动杆菌落与此充分混合，按推制血片的方法制成推片，自然干燥后用5% HCl室温下脱色1 min，细流水冲洗，再加结晶紫染液染色1 min，细流水冲洗，自然干燥后镜检。挑取两株荚膜厚度差异显著的细菌用于后续研究。

1.3 Raw 264.7细胞培养和细菌感染

按常规方法培养Raw 264.7细胞，待细胞生长至70%～80%时，用0.25%胰酶溶液消化细胞，洗涤后计数，计数5×105个细胞接种于6孔细胞培养板中，置于37℃、5%CO2环境中继续培养48 h。取鲍曼不动杆菌的新鲜振摇培养物，以无菌PBS缓冲液洗涤并调整细菌密度为1×109／mL［D（600 nm）＝1］。在生长融合至70%的Raw 264.7细胞（此时各孔细胞数量为1×106个）中分别加入两株不同荚膜厚度的鲍曼不动杆菌（细菌数量∶细胞数量＝10∶1），置于37℃、5%CO2环境中培养，于感染后1 h、3 h和6 h收集细胞样本。

1.4 实时定量PCR检测细胞NOD样受体家族3（NLRP3）、Caspase-1和IL-1βmRNA的表达

严格按照Vazyme公司总RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，并逆转录为cDNA。实时定量PCR反应条件是95℃预变性1 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸45 s，共35个循环。以GAPDH为内参，NLRP3、Caspase-1和IL-1β的基因表达量结果用2-△△Ct法表示，实验重复3次。

1.5 流式细胞术检测细胞活性氧

以无血清RPMI 1640培养液稀释DCFH-DA荧光探针至终浓度为10μmol／L的工作液，并将上述收集的细胞重悬于DCFH-DA工作液中，于37℃细胞培养箱内孵育20 min，间隔5 min颠倒混匀使探针和细胞充分接触。孵育结束后使用无血清RPMI 1640培养液反复洗涤细胞3次以完全除去未进入细胞内的DCFH-DA荧光探针，采用流式细胞仪检测细胞荧光强度。

1.6 统计学分析

应用SPSS16.0统计学软件，采用t检验分析感染组和对照组细胞基因和活性氧表达差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细菌荚膜染色结果

经刚果红染色后，鲍曼不动杆菌荚膜不着色，菌体被染成紫黑色，背景染成橘红色。经多次染色鉴定，我们选择出两株荚膜厚度不同的鲍曼不动杆菌用于后续研究，分别命名为Ab-B（薄荚膜菌株）和Ab-H（厚荚膜菌株）。从图1可见，Ab-H菌株周围有一个明显白圈，不被染料着色；而Ab-B菌株周围无明显白圈。

图1 鲍曼不动杆菌刚果红染色结果

2.2 鲍曼不动杆菌感染后Raw 264.7细胞NLRP3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表达

实时定量PCR检测结果显示，Ab-B菌感染后，Raw 264.7细胞NLRP3 mRNA表达量较对照组差异无统计学意义（P＞0.05），Caspase-1和IL-1β表达量较对照组显著升高（P＜0.05）；Ab-H菌感染后Raw 264.7细胞NLRP3、Caspase-1和IL-1βmRNA表达量较对照组均明显上调（P＜0.05），且NLRP3和IL-1β表达量显著高于Ab-B菌感染组（P＜0.05），但两组Caspase-1表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 鲍曼不动杆菌感染后Raw 264.7细胞NLRP3、Caspase-1和IL-1βmRNA表达量

2.3 鲍曼不动杆菌感染后Raw 264.7细胞活性氧表达

两株鲍曼不动杆菌感染Raw 264.7细胞后，1 h时感染组细胞活性氧表达量与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；3 h时感染组细胞活性氧表达量较对照组显著上升（P＜0.05），Ab-H株感染细胞活性氧表达量显著高于Ab-B株感染细胞（P＜0.05）；6 h时感染组细胞活性氧表达量进一步上升，Ab-H株感染细胞活性氧表达量显著高于Ab-B株感染细胞（P＜0.05）。见图3。

3 讨论

鲍曼不动杆菌是引起医院内感染的重要条件致病菌，随着近年来鲍曼不动杆菌耐药性愈加严重，可供临床医生选择的抗生素种类有限。但临床中并非所有的多重耐药鲍曼不动杆菌都会引起患者感染症状［7］。鲍曼不动杆菌易于在人体上呼吸道、泌尿生殖道和消化道等部位黏膜表面定植存在，其耐药性强，但不会激活免疫反应引起患者感染症状。因此患者呼吸道等部位检出鲍曼不动杆菌时，还需要鉴别其定植性或致病性，以便于临床医生选择合适治疗方案，避免抗生素的过度治疗。但目前对于鲍曼不动杆菌定植和致病的确切机制尚不完全清楚，严重阻碍了鲍曼不动杆菌的防治［8］。开展鲍曼不动杆菌激活宿主免疫系统机制的研究，可为鲍曼不动杆菌的治疗提供一条新思路［9］。

图3 各组细胞活性氧表达量

目前鲍曼不动杆菌毒力因子研究较少，现已明确的毒力因子有荚膜、外膜蛋白、脂多糖和外膜囊泡等［10］。荚膜是细菌经典的毒力因子，在细菌致病过程中发挥重要作用。荚膜可以保护细菌，使细菌能够在宿主吞噬细胞或腹腔积液中长时间存活，避免被宿主免疫细胞吞噬清除，并对宿主造成严重损害［11］。临床检验人员通常会将痰液涂片中存在于白细胞或脓细胞内的细菌判为致病菌，此类细菌通常具有较厚的荚膜，以利于细菌在白细胞中长时间存活［12］。

进一步研究发现，荚膜是细菌重要的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），可以被宿主天然免疫系统识别并激活免疫反应［13］。人体依靠一整套复杂的天然免疫机制和获得性免疫机制识别和清除侵入的病原菌，保护机体免受病原菌的侵害。宿主细胞通过模式识别受体（patten recognition receptors，PRRs）来识别鲍曼不动杆菌荚膜（即PAMPs）［14］。人类有多种不同功能的PRRs，其中存在于细胞质中的NOD样受体（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）是目前研究的热点［15］。NLRs的N-端是在蛋白之间有相互作用的效应结构域，C-端是识别PAMPs的亮氨酸富集结构域，中间部分为NOD结构域。在人体中，由NLRs、凋亡相关点样蛋白（ASC）和Caspase-1相互作用形成“炎症复合体”，用于识别胞内病原微生物及其代谢产物，通过激活Caspase-1，使IL-1β、IL-18和IL-33等促炎细胞因子成熟并释放到胞外，从而调节免疫应答并引起炎症反应［16］。现已报道的炎症复合体包括NLRP1、NLRP3、IPAF（the IL-1β-converting enzyme-protease activating factor）和AIM-2（absent in melanoma 2）4种，NLRP3是目前研究最多且最明确的一个，能够被多种病原体所激活，包括金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和流感病毒等，但目前缺乏鲍曼不动杆菌对宿主NLRP3激活的研究［17］。

现已发现鲍曼不动杆菌诱发肺部感染的关键在于NLRP3炎症复合体的活化，但其活化具体机制仍不完全清楚［18］。荚膜是鲍曼不动杆菌重要毒力因子，通常情况下鲍曼不动杆菌的荚膜不明显，传统墨汁负染法检测效果较差。本研究中我们采用改良的刚果红染色法检测鲍曼不动杆菌荚膜，该方法操作简单，可以清晰地观察到鲍曼不动杆菌荚膜的厚薄程度，涂片可以长期保存，便于随时复核。

我们的结果表明，鲍曼不动杆菌感染Raw 264.7细胞后，可以激活细胞活性氧表达，以及NLRP3、Caspase-1和IL-1βmRNA表达量，进而激活细胞炎症复合体的形成。厚荚膜菌株激活Raw 264.7细胞活性氧表达能力显著强于薄荚膜菌株，并且其活化Raw 264.7细胞NLRP3和IL-1β表达能力也明显强于薄荚膜菌株。该结果与肺炎克雷伯菌荚膜活化炎症小体能力相同［19］，表明鲍曼不动杆菌荚膜是潜在活化炎症复合体的重要因子，可以通过上调细胞活性氧表达进而激活炎症小体，导致患者免疫系统识别并清除鲍曼不动杆菌。活性氧是目前公认的炎症复合体激活因子［20］，主要来源于细胞线粒体。大量细菌荚膜可以激活宿主免疫细胞的吞噬反应，进而引起细胞“呼吸爆发”，产生超量活性氧，使NLRP3活化，导致人体正常组织和器官的损伤［21］。由此推测，荚膜厚度是影响鲍曼不动杆菌活化巨噬细胞炎症复合物能力的重要因素，具有厚荚膜的鲍曼不动杆菌可以诱导巨噬细胞产生过量活性氧，活化炎症复合体，使宿主固有免疫系统识别并清除鲍曼不动杆菌或进一步引起正常组织和器官损伤。