沙棘甾醇化合物的分离纯化研究

龚晨，高庆超，常应九，王悦，王树林，2，*

（1.青海大学农牧学院，青海西宁810016；2.青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海西宁810016）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）为胡颓子科沙棘属，包括柳叶沙棘、中国沙棘、中亚沙棘等。主要分布于我国青海、新疆等，种植面积占全世界的90%[1]。沙棘具有多种生物活性成分，如维生素C、黄酮、植物甾醇等。其中植物甾醇主要有β-谷甾醇、豆甾醇等，具有乳化性和稳定性，并能明显地降低体内胆固醇水平[2]，对肿瘤的生长和癌细胞的扩散具有一定的抑制效果[3]。此外，还可促进机体对免疫系统的调节，并具有较强的抗氧化作用，已运用于医药、化妆品、食品、光学产品、植物基因工程等相关领域[4]。

目前国内外对植物甾醇提取分离的方法有皂化法、酯化法、溶剂结晶法、酶法和沸石吸附法等[5-6]。其中，最常用的方法是溶剂结晶法。该法可制备出高纯度的产品，且具有简便的工艺流程，适合工业化的连续生产。确定规模化生产前的工艺数据，是β-谷甾醇生产工艺研究的关键内容[7]。植物甾醇的纯化主要采用大孔树脂吸附法、分子蒸馏法、超临界CO2萃取法等[8-9]。由于大孔吸附树脂有较高的稳定性、较好的吸附选择性、较温和的解吸条件、较长的使用周期等特点，因而具有较好的纯化效果。植物甾醇的鉴定方法主要有反式高效液相色谱法、红外光谱法、薄层色谱法和气相色谱法等[10]。其中，薄层色谱法快捷简便、成本低，适合用作混合物中主要成分的快速分离与鉴定。

本试验采用皂化法通过单因素和正交试验确定制备β-谷甾醇粗制品的最佳工艺参数；利用重结晶法和大孔吸附树脂法对甾醇粗制品进行精制和纯化，并用薄层色谱法进行鉴定，以便提高β-谷甾醇的纯度。该研究结果可为今后沙棘中生物活性成分（β-谷甾醇）的理论研究、产品开发及工业化生产提供一定的理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

AL204 万分之一分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PHSJ-4A 型pH 计：上海仪电分析仪器有限公司。

沙棘籽油：青海清华博众生物技术有限公司；β-谷甾醇标准品（98%）：合肥博美生物科技有限责任公司；AB-8 大孔树脂：天津波鸿树脂科技有限公司；无水乙醇（AR）：天津市富宇精细化工有限公司；三氯化铁（AR）：昌邑宏达化工有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 β-谷甾醇标准曲线的绘制

将20 mg β-谷甾醇标准品溶于10 mL 无水乙醇中，配制成2 mg/mL β-谷甾醇标准溶液。使用时稀释10 倍，分别取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 的200 μg/mL β-谷甾醇标准溶液于试管中，均以无水乙醇定容至4 mL，加入硫磷铁显色剂2 mL，振荡摇匀，室温下静置15 min 后进行全波长扫描，并在最大吸收波长处测定吸光值。以β-谷甾醇溶液质量浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 β-谷甾醇含量的的测定

将供试甾醇样品配制成浓度为0.04 mg/mL 的溶液。按照1.2.1 中的操作方法，于最大吸收波长处测定其吸光值，并计算β-谷甾醇含量[11]，公式如下：

β-谷甾醇百分含量/%=（W×V×T）/M×100

式中：W为吸光值对应的样品中β-谷甾醇的浓度，mg/mL；V为定容体积，mL；T为稀释倍数；M为样品质量，mg。

1.2.3 β-谷甾醇的鉴定

参照文献并稍作修改[12-14]，采用薄层色谱法进行鉴定。以石油醚∶乙醚=8∶2（体积比）的混合液为展开剂，10%的硫酸-无水乙醇溶液为显色剂，计算比移值，以鉴定混合物中的甾醇种类。

参照公式：Rf=A/B

式中：A为原点至斑点的距离，cm；B为原点至溶剂前沿的距离，cm。

1.2.4 沙棘甾醇分离纯化工艺

沙棘籽油→皂化→旋转蒸发浓缩→乙酸乙酯萃取→水洗至中性→旋转蒸发浓缩→干燥→甾醇粗制品→重结晶→甾醇精制品→大孔树脂吸附→薄层色谱鉴定

准确称取2.0 g 沙棘籽油于100 mL 具塞三角瓶中，按照比例加入50%KOH-无水乙醇混合液，置于恒温振荡器中皂化，震荡结束后，立即将皂化液放入冰水浴中冷却。加入90 mL 蒸馏水，用30 mL 乙酸乙酯萃取3 次，合并上清液，再用蒸馏水洗涤至中性。用旋转蒸发仪蒸发至体积约30 mL 后，烘干称重，即为甾醇粗制品，并计算其得率（得率/%=甾醇粗制品质量/原料油质量×100）。

取一定量甾醇粗制品，加热溶于适当体积的无水乙醇，置于4 ℃冰箱内养晶一段时间后，减压抽滤，收集滤纸上的晶体，并用旋转蒸发仪除去母液中的部分乙醇后，再次将其放置冰箱中继续养晶，一定时间后再次抽滤；重复3 次上述步骤。收集不同结晶时间得到的晶体，即为甾醇精制品，测定其中β-谷甾醇的含量。

利用大孔树脂吸附法，将吸附液上样并静置数小时后，加入解吸液进行洗脱，收集具有相同时间间隔的流出液，并将其烘干称重，测定其中β-谷甾醇的含量。并将纯化前后的β-谷甾醇分别进行薄层色谱鉴定。

1.2.4.1 β-谷甾醇粗制品制备的单因素试验

参考相关文献及预试验结果[15]，考察50%KOH-无水乙醇溶剂配比为1∶1、1∶5、1∶10、1∶15（体积比）；料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）；皂化时间为1、2、3、4 h；皂化温度为70、80、90、95 ℃对 β-谷甾醇粗制品得率的影响。

1.2.4.2 β-谷甾醇粗制品制备的正交试验

参考文献[15]及单因素试验结果，正交试验考察的因素为溶剂配比、料液比、皂化温度、皂化时间，指标为甾醇粗制品得率，按照正交表L9（34）设计四因素三水平正交试验，正交试验因素水表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Levels and factors of orthogonal experiment

1.2.4.3 重结晶次数对β-谷甾醇纯度的影响试验

称重干燥后的甾醇粗制品，按料液比为1∶15（g/mL）的比例加入无水乙醇加热至溶解，放置于冰箱4 ℃下养晶24 h，减压抽滤后，收集滤纸上的晶体，并用旋蒸仪使滤出母液的体积浓缩至原体积的1/2 并放置在4 ℃的冰箱中，养晶24 h 后再次减压抽滤；重复上述步骤3 次。将收集的晶体干燥保存，分别测定其中β-谷甾醇的含量。

1.2.4.4 β-谷甾醇的纯化及鉴定

采用大孔吸附树脂法，参考文献并作修改[16]。本试验选用AB-8 大孔吸附树脂，将晶体配制成0.10 mg/mL的吸附液；解吸液按照95%乙醇∶三氯甲烷=1∶5（体积比）进行配制。将吸附液上样4 h 后，加入解吸液进行洗脱，每隔15 min 分别对流出液进行收集，将收集液放置于60 ℃的烘箱中使溶剂全部蒸发后称重，再用无水乙醇配制成0.1 mg/mL 的待测液，测定其吸光值，计算β-谷甾醇的含量。

将纯化前后的β-谷甾醇分别利用薄层色谱法对混合物中甾醇的种类进行定性分析。

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS2.0 软件和Excel 软件进行数据处理与分析。

2 试验结果与分析

2.1 β-谷甾醇的标准曲线

对β-谷甾醇标准溶液进行全波长扫描，确定其最大波长为442 nm（如图1所示）。以β-谷甾醇标准溶液质量浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y=0.229x+0.032（R2=0.998 8），其中y 为吸光值A；x 为β-谷甾醇标准溶液质量浓度（如图2）。

图1 β-谷甾醇标准品的全波长扫描图Fig.1 Scanning diagram of full wavelength of β-sitosterol sample

图2 β-谷甾醇标准曲线Fig.2 The standard curve of β-sitosterol

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 溶剂配比对甾醇粗制品得率的影响

溶剂配比对甾醇粗制品得率的影响见图3。

图3 溶剂配比对甾醇粗制品得率的影响Fig.3 Effects of solvent ratio on the yield of sterol crude products

由图3可以看出，溶剂50%KOH-无水乙醇配比为1∶10（体积比）时，甾醇粗制品得率达到最大，随溶剂配比进一步增大，得率有小幅度下降。原因是当溶剂配比较低时，皂化不够充分，导致得率较低；溶剂配比过高时，增加了水洗难度[10]。所以溶剂配比1∶10（体积比）为最佳。

2.2.2 料液比对甾醇粗制品得率的影响

料液比对甾醇粗制品得率的影响见图4。

图4 料液比对甾醇粗制品得率的影响Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on the yield of sterol crude products

由图4可知，当料液比1∶15（g/mL）时，甾醇粗制品得率最高。这是由于料液比较低时，提取不够充分，导致得率较低；料液比较高时，水洗过程中KOH 与甾醇分离不完全，同时也增加了试剂用量的需求和后期浓缩的难度[10]。所以料液比1∶15（g/mL）最为合适。

2.2.3 皂化时间对甾醇粗制品得率的影响

皂化时间对甾醇粗制品得率的影响见图5。

图5 皂化时间对甾醇粗制品得率的影响Fig.5 Effects of saponification time on the yield of sterol crude products

由图5可知，随皂化时间的延长，甾醇粗制品得率呈现先增后降的趋势。最佳皂化时间确定为2 h。皂化时间过短，导致皂化不完全。皂化时间过长，不易萃取分离，且会增加生产成本，降低生产效率。因此，最佳皂化时间为2 h。

2.2.4 皂化温度对甾醇粗制品得率的影响

皂化温度对甾醇粗制品得率的影响见图6。

由图6可知，甾醇粗制品得率由于皂化温度不同，呈现一定幅度的变化，且最适皂化温度为90 ℃。随皂化温度上升，得率下降，原因是温度升高可加速溶质的扩散和溶剂的渗透，使β-谷甾醇不断溶出；但温度过高会加快杂质的溶出，影响β-谷甾醇粗制品得率。所以最佳皂化温度为90 ℃。

图6 皂化温度对甾醇粗制品得率的影响Fig.6 Effects of saponification temperature on the yield of sterol crude products

2.3 正交试验结果与分析

以溶剂配比、液料比、皂化温度、皂化时间为考察因素，以甾醇粗制品得率为评价指标，采用L9（34）设计四因素三水平正交试验，优化甾醇粗制品提取工艺，试验结果见表2。

表2 正交试验方案及结果Table 2 Results and scheme of orthogonal experiment

根据表2，由极差分析可知，对β-谷甾醇粗制品得率产生影响的的主次因素：溶剂配比＞料液比＞皂化温度＞皂化时间。优选组合为A3B3C2D1，即溶剂配比1∶12.5（体积比）、料液比1∶17.5（g/mL）、皂化温度90 ℃、皂化时间1.5 h。在此条件下甾醇粗制品的得率为（2.41±0.18）%。在验证试验中，按照最佳工艺条件制得的晶体中，β-谷甾醇的含量达到（91.41±0.21）%。

2.4 重结晶次数对β-谷甾醇纯度的影响结果

重结晶次数对β-谷甾醇纯度的影响结果见图7。

由图7可知，样品中β-谷甾醇纯度随重结晶次数增加而下降，第一次结晶得到的晶体中，β-谷甾醇含量为（91.41±0.75）%；第二次得到的晶体中，β-谷甾醇的含量为（72.81±0.12）%，第三次得到的晶体中，β-谷甾醇的含量为（56.03±1.39）%。

图7 重结晶次数对β-谷甾醇纯度的影响Fig.7 Influence of recrystallization number on the purity of βsitosterol

2.5 大孔吸附树脂纯化结果

洗脱时间对β-谷甾醇纯度影响的结果见图8

图8 洗脱时间对β-谷甾醇纯度的影响Fig.8 Influence of elution time on the purity of β-sitosterol

由图8可知，用解吸液进行洗脱时，随时间的延长，β-谷甾醇的纯度呈现先上升后下降的走势。在46 min～60 min 的时间段内，收集液中β-谷甾醇含量的含量最高，干制后产品中β-谷甾醇含量为（93.54±0.18）%；在46 min～90 min 内，β-谷甾醇百分含量均在92%以上，达到了一定的纯化效果。

2.6 薄层色谱鉴定结果与分析

对纯化后的沙棘β-谷甾醇的采用薄层色谱进行鉴定，鉴定结果见图9。

图9 薄层色谱鉴定图Fig.9 Chart of TLC identification

由图9可知，纯化前后的样品中都只有一种组分，且该组分与β-谷甾醇标准品有相同的比移值（Rf=0.29±0.01），因此，可以推断该混合物的组分为β-谷甾醇。

3 讨论

在试验中，采用皂化法提取沙棘籽油中甾醇化合物，通过单因素试验与正交优化设计确定了提取最佳工艺条件为：溶剂50%KOH-无水乙醇配比1∶12.5（体积比）、料液比1∶17.5（g/mL）、皂化温度90 ℃、皂化时间1.5 h。在此条件下甾醇粗制品得率为2.41%。这为今后沙棘籽油中甾醇成分的研究提供参考。由于皂化法的弊端，使得沙棘籽油在经过皂化完成后无法再次利用，因此，优化或开发新的甾醇提取分离方法将是今后的一个研究重点与难点。

由图7可知，重结晶过程中，β-谷甾醇纯度可达（91.41±0.75）%，这是由于温度降低时，β-谷甾醇的溶解度急剧下降，而其他种类甾醇的溶解度变化不明显[17]，从而达到精制效果。许文林等[18]研究发现在结晶时间20 h 时，β-谷甾醇纯度最高，与本试验结果基本吻合。

由图8可知，随着洗脱时间的延长，β-谷甾醇纯度先上升后下降。原因是在开始洗脱时，由于β-谷甾醇未完全溶解到解吸液中，导致初始阶段的收集液中β-谷甾醇浓度偏低[19]；在46 min～90 min 时，β-谷甾醇纯度达到92%以上。这将为今后沙棘功能活性成分（β-谷甾醇）高附加值产品的研发提供理论依据。

4 结论

皂化法制备甾醇粗制品的最佳工艺条件为：料液比1∶17.5（g/mL）、溶剂50 % KOH：无水乙醇配比1∶12.5（体积比）、皂化时间1.5 h、皂化温度90 ℃，得率为2.41%。通过重结晶法精制，β-谷甾醇纯度可达91.41 %。利用大孔吸附树脂法纯化时，洗脱时间在46 min～60 min 内，β-谷甾醇纯度达到93.54%，经薄层色谱法鉴定，纯化后的沙棘甾醇为β-谷甾醇。