酸枣仁萌发期酸枣仁皂苷A、B及斯皮诺素的含量变化

黄之镨，何志明，张雯洁，马伟光，袁玉鲜，陈海丰，*

（1.云南中医药大学中药学院，云南昆明650500；2.云南省食品药品监督检验研究院，云南昆明650000）

酸枣仁为枣属植酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.Spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的种子[1]，是一种常用的药食两用物质。具有养心安神、敛汗的功效，临床常用于心悸失眠，体虚多汗等症。研究发现，酸枣仁含有三萜及皂苷、黄酮类、生物碱、脂肪酸等化学成分，具有镇静催眠、抗心律失常、镇痛、抗惊厥等多种药理活性，其中又以镇静催眠作用应用最广[2-3]。种子经萌发处理，不仅营养价值得以提高，化学成分、药理活性也会发生改变，还会带有口感与气味的醇化[4]。酸枣仁皂苷A、B 及斯皮诺素作为酸枣仁的主要活性成分[5-8]，常用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定含量。为探究酸枣仁萌发对活性成分含量的影响，本文参考2015年版《中国药典》中酸枣仁及其加工品的质量评价指标，采用HPLC 测定不同萌发时间对酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B 及斯皮诺素含量的影响，为酸枣仁萌发中主要活性成分的变化提供一定的试验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UltiMate 3000 高效液相色谱仪（包括四元梯度泵、自动进样器、UV 检测器、柱温箱）：美国DIONEX 公司；SKF-6 超声清洗器：上海科导超声仪器有限公司；GX-200 万分之一分析天平：日本A&D；Millipore 超纯水处理系统：美国Millipore 公司。

1.2 材料与试剂

酸枣仁皂苷A 对照品（批号AF8042003）、酸枣仁皂苷B 对照品（批号AF8042001）：成都埃法生物科技有限公司；斯皮诺素对照品（批号20170306）：上海莼试生物有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯）：天津市康科德科技有限公司；水为超纯水，其余所用试剂均为分析纯；酸枣仁购于药材市场，经云南中医学院张洁副教授鉴定为枣属植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Huex H.F.Chou 的干燥成熟种子。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 酸枣仁皂苷A、B 的色谱条件

色谱柱：Kromat Universil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脱（0～15 min，20 %A→40 %A；15 min ～28 min，40 %A；28 min～30 min，40 %A→70 %A；30 min～32 min，70 %A→100 %A）；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：203 nm[1]。在上述条件下，酸枣仁中酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B 达到基线分离，样品中的其他成分对分析无明显干扰。结果见图1。

2.1.2 斯皮诺素的色谱条件

色谱柱：Kromat Universil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：20 ℃；流动相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脱（0～10 min，12 %A→19 %A；10 min～16 min，19 %A→20%A；16 min～22 min，20%A→100%A；22 min～30 min，100 %A）；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：335 nm[1]。在上述条件下，酸枣仁中斯皮诺素达到基线分离，样品中的其他成分对分析无明显干扰。结果见图2。

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 酸枣仁皂苷A、B 混合对照品溶液

精密称取酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B 各2.0 mg，置10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得酸枣仁皂苷A、B 质量浓度分别为0.2、0.2 mg/mL 的混合对照溶液，备用。临使用前0.45 μm 的微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.2.2 斯皮诺素对照品溶液

精密称取斯皮诺素2.0 mg，置10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得斯皮诺素质量浓度为0.2 mg/mL 的对照溶液，备用。临使用前0.45 μm 的微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.3 供试样品的制备

分别取酸枣仁及萌发3、4、5、6、7、8、9、10 d 的芽品粉末（过四号筛）约l g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚适量，加热回流4 h，弃去石油醚液，酸枣仁渣晾晒挥去溶剂，转移至具塞锥形瓶中，加入70%乙醇20 mL，加热回流2 h，过滤，滤渣用70%乙醇5 mL 洗涤，合并洗液与滤液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得酸枣仁皂苷A、B 测定供试液。取上述供试液1mL 置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得斯皮诺素测定供试液。测定时用0.45 μm 的微孔滤膜过滤。

2.4 线性关系的考察

分别精密量取酸枣仁皂苷A、B 混合对照品溶液、斯皮诺素对照品溶液1、2、3、5、8、10 μL，分别按2.1 色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。分别得酸枣仁皂苷A、枣仁皂苷B、斯皮诺素的回归方程为：y=10.87x+2.29（R2=0.999 9）、y=13.21x+2.02（R2= 0.999 5）、y=9.65x+3.27（R2=0.999 8）。结果表明酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素的进样量在0.2 μg～2.0 μg 范围内都具有较好的线性关系。

2.5 精密度试验

分别取酸枣仁皂苷A、B 混合对照品溶液、斯皮诺素对照品溶液各10 μL，按照2.1 色谱条件连续进样6次，测定峰面积。酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素等峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为0.88%、0.94%、0.64%，均小于2%，表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性试验

取酸枣仁芽品S9（萌发9 d）样品5 份，按2.3 方法平行制备，按照2.1 色谱条件测定峰面积。结果表明酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素含量分别为0.15、0.75、4.64 mg/g；RSD 分别为1.57%、1.24%、0.92%，表明方法的重复性良好。

2.7 稳定性试验

分别取酸枣仁皂苷A、B 混合对照品溶液、斯皮诺素对照品溶液，22 ℃放置，分别于制备好后的0、2、4、8、12、24 h 进样测定峰面积。结果酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素的峰面积RSD 分别为1.83 %、1.79%、1.50%，表明样品在24 h 内稳定性较好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的酸枣仁芽品S9（第9 天，酸枣仁皂苷A 含量为0.15 mg/g、酸枣仁皂苷B 含量为0.75 mg/g、斯皮诺素含量为2.93 mg/g）1 g，平行6 份，按相当于样品溶液中酸枣仁皂苷A、B 和斯皮诺素含有量的100 %加入对照品。按2.3 样品制备方法制得样品溶液，按照2.1 条件测定峰面积，计算回收率。结果酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B 和斯皮诺素的平均加样回收率（n=6）分别为98.51%、98.88%、100.39%，RSD 分别为0.62%、0.35%、0.88%。结果详见表1。

表1 样品回收率试验结果Table 1 The recovery of the method

2.9 样品的测定

分别取酸枣仁及萌发3、4、5、6、7、8、9、10 d 的芽品粉末，每份约1 g，精密称定，按2.3 下同法制备成供试品溶液，分别精密吸取10 μL 注入色谱仪，记录酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B 及斯皮诺素的峰面积，并计算含量。结果见表2。

3 结论与讨论

萌发是指种子吸胀后，内部代谢作用增强，与种子萌发相关的基因开始表达，胚根逐渐伸长并突破种皮的生物学过程，由外界环境因子、体内激素含量及信号传导和若干关键基因协同调控[9]。在萌发中，种子本身所含有的化学物质又参与分解代谢或合成，从而使化学物质的含量发生变化[10]。试验结果发现，酸枣仁在萌发过程中，酸枣仁皂苷A 随着萌发时间的延长，含量明显降低；酸枣仁皂苷B 随着萌发时间延长含量明显升高，并在萌发第7 天达到峰值，然后又稍有降低；斯皮诺素含量则先降低随后升高到酸枣仁水平（萌发第6 天），然后随萌发时间延长而降低。表明酸枣仁萌发时酸枣仁皂苷A、B 及斯皮诺素的含量变化与萌发时间具有一定的联系，为酸枣仁芽品的质量控制提供了一定的试验依据。从含量变化看，酸枣仁皂苷A、B 呈现一定的互补式增减，且酸枣仁皂苷A、B 结构上的差异仅为一个葡萄糖，但萌发中是否由酸枣仁皂苷A 脱去一分子葡萄糖生成酸枣仁皂苷B 还有待于进一步研究。

表2 萌发期酸枣仁皂苷A、B及斯皮诺素的动态变化（n=2）Table 2 The jujuboside A，B and spinosin contents changed of seed of Ziziphus jujuba var.Spinosa at germination time（n=2）

酸枣仁皂苷及黄酮均具有较好的药用价值，萌发中皂苷及黄酮的含量变化对酸枣仁芽在保健品和医药制品的研制方面是否有一定的开发价值，将进一步通过药理研究来阐述。综上，该方法的稳定性、精密度、重复性良好，适合于测定该酸枣仁芽品中酸枣仁皂苷A、B 及斯皮诺素的含量测定，为酸枣仁萌发中主要活性成分变化及酸枣仁芽品的质量控制提供了一定的试验依据。