p75NTR对小鼠坐骨神经挤压伤后神经功能的影响

陈晓娟1，田 甜，张建国1，王贤军1，范新蕾

(1 临沂市人民医院，山东 临沂 276003；2 山东医学高等专科学校)

p75神经营养素受体 (p75NTR)参与调控不同的信号传导通路，介导神经细胞的生长和凋亡[1]，其生物学功能取决于受体复合体的相互作用、配体的特性和激动信号的传导途径等[2]。p75NTR表达与周围神经损伤后神经再生和神经保护存在密切的关系。但目前p75NTR对周围神经损伤后神经功能的影响尚不明确。行为学研究可以从功能学角度证明再生神经能否与靶器官建立有效的神经连接[3]。本实验通过观察p75NTR基因敲除小鼠在坐骨神经挤压伤后行为学变化，探讨p75NTR对小鼠坐骨神经挤压伤后神经功能的影响。

1 材料和方法

1.1实验小鼠及分组 随机将20只野生型C57BL/6雄性小鼠(购自维通利华实验动物技术公司)分为模型组和假手术组，每组各10只；另选取p75NTR基因敲除C57BL/6雄性小鼠10只为p75NTR-/-组(由Jackson实验室提供，通过交配扩群后经基因鉴定获取)。所有实验小鼠为8～10周龄，体重22～25 g，在层流环境饲养，保持室温(24±2)℃，湿度(55±5)%，每日光控时间12 h。

1.2实验试剂和仪器 异氟烷(雅培制药有限公司)；手术操作显微镜(型号 L2L-12)；显微外科手术包(中兴名业科技公司，型号SSW-1型)；精细无齿血管钳(FST，型号13006-12)。

1.3动物模型制备 小鼠坐骨神经挤压伤模型使用钳夹法制作[4]。小鼠吸入98%氧气+2%异氟烷麻醉成功后，俯卧位固定在操作台上，常规备皮、消毒后在小鼠左侧臀部斜行切开2 cm切口，逐层分离，暴露坐骨神经，使用FST精细无齿血管钳在坐骨结节远端5 mm处钳夹坐骨神经，定量钳压1扣，持续60 s。模型组和p75NTR-/-组小鼠行左侧坐骨神经钳夹，假手术组仅分离暴露左侧坐骨神经，未行神经钳夹，其余处理3组相同。

1.4行为学观察方法

1.4.1小鼠坐骨神经功能指数(SFI) 制作长为50 cm、宽5 cm、高10 cm的小鼠行走足迹暗箱，箱底放置相同面积白纸[5]。用墨汁充分印染小鼠后足，使小鼠自主从暗箱一侧行走到对侧，取出箱底白纸，选择双侧清晰足印3～4个，图像扫描后，使用Image J处理软件分析图像。SFI=118.9(ETS-NTS)/NTS-51.2(EPL-NPL)/NPL-7.5，公式中NTS为健侧足趾宽度，NPL为健侧足印长度，ETS为术侧足趾宽度，EPL为术侧足印长度。在成模前及成模第7、14、21、28和35天分别对各组小鼠行走足印分析，并计算SFI。

1.4.2趾展试验 采用趾展试验[6]评估坐骨神经挤压伤后小鼠患肢神经功能恢复情况。操作方法为捉尾提起小鼠，在小鼠健侧足趾完全伸展开时，对患肢足趾伸展程度分级评分。具体分级标准为：患肢没有足趾伸展为0级；患肢足趾部分伸展为1级；患肢足趾完全伸展，并且维持伸展状态超过2 s为2级。操作时注意双侧对比，每日每只小鼠测试2次，2次测试间隔大于45 min。

1.4.3斜板试验 在成模前及成模第7、14、21、28和35天使用斜板试验评估小鼠患肢运动功能恢复情况。将两块长方形木板使用铰链连接，一块板为底板，另一块为转动板，转动板上平铺一层粗糙胶板垫。在转动板水平位时，将小鼠放置于转动板的中央位置，然后缓慢匀速增加转动板倾斜角度，保持小鼠头向上且身体纵轴方向与斜板纵轴一致，记录小鼠在转动板上停留超过5 s的最大倾斜度数，连续测量3次，计算平均值。

2 结果

2.1大体观察 3组小鼠切口愈合良好，手术部位无红肿。术后健康状况良好，所有小鼠至实验完成时均存活。模型组小鼠成模后患侧肢体出现跛行、拖地行走、足趾伸展受限及患肢小腿肌群萎缩、足部红肿等坐骨神经损伤表现，且p75NTR-/-组小鼠上述表现更为严重。假手术组小鼠无上述神经受损表现，术后3～5 d即可恢复正常活动。

2.2p75NTR对小鼠伤后SFI的影响 随着成模后时间的延长，模型组和p75NTR/组SFI呈改善趋势(P<0.01)，但成模后各时间点p75NTR-/-组SFI均低于模型组(P<0.05)，见表1。

表1 3组小鼠SFI的比较

2.3p75NTR对小鼠伤后趾展试验的影响 3组初始反应时间及完全反应时间比较均有统计学意义，两两比较显示，p75NTR-/-组反应时间较模型组明显延长(P<0.01)，见表2。

2.4p75NTR对小鼠伤后斜板试验的影响 随着时间的延长，模型组和p75NTR-/-斜板试验度数均有改善(P<0.05)，但成模后各时间点p75NTR-/-组SFI均低于模型组(P<0.05)，见表3。

表2 3组小鼠趾展试验结果比较

表3 3组小鼠斜板试验结果比较度)

3 讨论

跨膜受体p75NTR与神经营养素结合，通过调控不同的信号通路，调节细胞生长和凋亡[1]。周围神经损伤时p75NTR的表达明显上调，p75NTR过表达可能与损伤神经再生修复有关[2]。笔者前期实验发现，p75NTR基因敲除小鼠在坐骨神经损伤前后使用Westernblot均未检测到p75NTR蛋白表达；而在坐骨神经损伤前野生型小鼠p75NTR蛋白呈低水平表达，在坐骨神经挤压伤后p75NTR表达明显上调，且其表达水平与神经损伤后时间密切相关。但目前p75NTR对周围神经损伤后神经再生作用及神经功能的影响仍不清楚。

在行为学研究中，足印SFI分析可以用于评估坐骨神经损伤后运动功能恢复情况，从而反映坐骨神经再生水平[7]。本实验结果发现，p75NTR-/-组小鼠较模型组步间距缩短，患侧足趾不能伸展着地，PL、TS参数存在明显变异。在成模后各时间点p75NTR-/-组p75NTR基因敲除小鼠SFI显著差于模型组。小鼠在坐骨神经损伤后存在行走差异，可能导致SFI对坐骨神经功能评估存在偏倚，使用趾展试验评估小鼠坐骨神经运动功能以弥补SFI的缺陷[8]。本实验结果显示，p75NTR-/-组小鼠趾展功能恢复正常时间较模型组小鼠延迟7 d，趾展试验初始反应时间、完全反应时间均显著长于模型组。小鼠周围神经损伤修复的关键期大约在损伤35 d内，超过这个时期神经修复力会明显下降[6]。周围神经损伤后再生轴突与失神经远端突触再建延迟可能是造成神经功能受损的原因之一。本实验结果发现，尽管p75NTR基因敲除小鼠趾展试验恢复正常时间未超过这个时间窗，但是趾展功能初始反应时间和完全恢复时间均长于野生型小鼠，说明p75NTR对坐骨神经挤压伤后神经功能恢复发挥重要作用。斜板试验进一步量化小鼠坐骨神经损伤后肢体肌力恢复情况，结果发现在坐骨神经挤压伤成模后各时间点p75NTR基因敲除小鼠患肢肌力均明显差于野生型小鼠。

综上所述，p75NTR基因敲除小鼠坐骨神经挤压伤后SFI、趾展试验、斜板试验等行为学指标均差于野生型小鼠，说明p75NTR对小鼠坐骨神经损伤后神经功能恢复发挥重要作用。