CRP基因多态性及其hsCRP水平与VCI的相关性

(1山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000；2山东医学高等专科学校附属医院)

血管性认知功能障碍(Vascular cognitive impairment，VCI)是一组由各种不同血管危险因素导致的认知功能损害综合征，起病隐匿，临床早期症状不易识别，容易误诊和漏诊，晚期发展成为血管性痴呆。该病可能是环境、遗传及其它脑血管疾病危险因素相互作用的结果，其基础病变是动脉粥样硬化，炎症在动脉粥样硬化的发生发展的各个阶段都起着重要作用[1]，是缺血性卒中及心血管疾病的独立危险因素。近年来，遗传因素作为VCI的危险因素逐步受到重视，有研究发现CRP+1059G/C(rs1800947)基因与动脉硬化相关[2]。但关于CRP+1059G/C(rs1800947)基因多态性与VCI遗传易感性之间的研究相对较少。为此，本研究探讨VCI炎症的关键易感基因位点和生物学标志物，为早期防治提供理论依据。

1 对象和方法

1.1对象选择 选取2016年3月-2018年9月本院神经内科门诊或住院VCI患者80例，其中男48例，女32例，平均年龄(56.3±6.4)岁。诊断标准：严格按照《中国血管性认知障碍诊疗指导规范》(2016)的诊断标准[3]。排除标准：各种意识障碍；其他神经系统疾病所致的认知功能障碍；全身性疾病所致的认知功能障碍；精神疾病；不适合量表评估的情况，如失语、感觉运动或视觉障碍等。另选取80例健康体检者作为对照组，其中男46例，女34例，平均年龄(57.6±7.2)岁。两组患者在性别比、年龄等方面比较均无统计学差异(P>0.05)。本研究获得医院伦理委员会审核同意，所有研究对象均已书面告知并获得知情同意。

1.2方法

1.2.1标本采集 全部受检者清晨空腹抽取外周静脉血6 ml分别置于EDTANa2抗凝液管中，其中2 ml静止离心后分离血清，并将其储存于-80℃冰箱待最终测定hsCRP浓度，其余4 ml采用酚氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA，于-80℃冰箱冻存备测。测量前均进行标准品标定，严格进行质控。

1.2.2hsCRP测定 利用散射免疫比浊法检测，试剂采用Dade-Behring试剂盒，抗体液、补充试剂、标准品、Dade-Behring校正液以上均由Dade- Behring公司提供。利用6点定标方式建立标准曲线储存于仪器内，最低检测底线为0.15 mg/L。系统自行对标本进行1∶20稀释后检测。当检测结果>5 mg/L时系统自动对标本增加稀释倍数后复查。

1.2.3CRP基因多态性检测 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法对两组rs1800947位点基因型进行检测，聚合酶链反应(PCR)上游引物：5′-GATCTGTGTGTGATCTGAGAAACCTCT-3′,下游引物：5′-GAGGTACCAGAGACAGAGACGTG-3′，由上海生物工程技术服务有限公司合成。扩增反应体系：包含为25 μL，DNA模板2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，2倍master mix 12.5 μL，加灭菌双蒸水至25 μL，震荡混匀。采用德国Biometra PCR扩增仪进行扩增，扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，共循环35次，72℃再延伸10 min，4℃保存备用。酶切反应体系：PCR产物10 μL，10×BufferR 2 μL，内切酶NmuCI 2 U，加灭菌双蒸水至20 μL，震荡混匀后置于37℃恒温水浴箱中温育13 h，酶切反应终止后，用20%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物，室温恒压100 V电泳70 min，再硝酸银染色30 min后，可直接显影观察电泳条带，区分各研究对象基因型，分析统计基因型频率。

1.2.4实验室及影像学检查 测定全部患者的血小板记数(PLT)、白细胞计数(WBC)、血清胆固醇(TCH)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、纤维蛋白原含量(FBG)等，以及颅脑磁共振检查。

2 结果

2.1两组相关指标的比较 两组TCH、TG、WBC等相比均无统计学意义；实验组hsCRP水平明显高于对照组。见表1。

表1 两组相关指标的比较

2.2两组CRP1059G/C基因型和等位基因频率分布 CRP1059G/C的基因型分布均符合 Hardy-Weinberg定律。一般人群中以上基因位点各等位基因已经达到遗传平衡，具有较好的人群代表性。两组基因型频率与等位基因的分布比较差异无统计学意义。见表2。

2.3各基因型hsCRP浓度的比较 对照组各基因型hsCRP浓度比较无统计学差异；实验组内各基因型患者中血清hsCRP浓度比较有统计学意义，两两比较显示：GG高于GC、CC基因型患者(q=5.97,8.32；P<0.05)，GC、CC基因型之间无统计学意义(q=0.32，P>0.05)。两组间比较GG基因型hsCRP浓度有显著性差异(t=8.37，P<0.01)，GC、CC基因型CRP无显著性差异(P>0.05)。见表3。

表2 两组基因型频率及等位基因频率分布比较

表3 CRP基因型与hsCRP浓度的关系的比较

3 讨论

VCI由脑血管病相关的危险因素如高血压、糖尿病、高血脂等以及明显或不明显脑血管病如脑梗死、脑出血、腔隙状态、白质疏松和慢性脑的低灌注等所致，涵盖了从轻度认知障碍到重度认知障碍，也包括阿尔茨海默病等病理改变在内的认知损害全部过程，炎症参与了血管性认知功能损害的病理生理过程。早期识别VCI并进行危险因素干预及治疗，在一定程度上可逆转VCI的发生及发展，避免发展到血管性痴呆晚期阶段。朱海生等[4]研究发现，患者hsCRP水平与VCI程度呈正相关，其水平越高，VCI越严重，hsCRP可能是VCI早期干预的重要指标。

hsCRP作为急性时相蛋白，半衰期较长，稳定性好，灵敏度高[5]，被视为理想的炎症标志物和动脉粥样硬化发生、发展的预测因子。hsCRP的水平除了受糖尿病、生活行为方式、环境等影响以外，还受遗传因素的影响，可达到22%～56%[6]。CRP基因位于人染色体组1q21～1q23区带，包含有1个内含子和2个外显子，共有2 263个核苷酸组成，编码206个氨基酸残基，其中一个重要位点基因为rs1800947(1059G/C)，位于第2外显子的一个氨基酸的同义或其他变异，可能由于同一氨基酸对简并密码子的翻译效率不同或转录水平的差异，而导致蛋白质表达量上的改变，达到一定程度可致VCI发生。Singh等[7]研究发现，rs1800947和rs1130864与CRP水平升高有密切关系。Schulz等研究发现携带GG基因型的rs1800947位点或CRP水平升高的患者发生心血管事件的风险更高[8]。

本研究发现，VCI的GG基因型患者的hsCRP浓度高于GC、CC基因型患者，说明GG基因型直接改变hsCRP的基线水平，其遗传变异性可能与VCI易感性有关，发生VCI的风险更高。CRP1059G/C基因GG基因型可能是VCI危险因素之一，其对hsCRP的影响在某种程度上也解释了某些炎症相关疾病的种族特异性和个体差异性。实验组和对照组1059G/C各基因型和等位基因的分布趋势无统计学意义，可能与样本较少有关，还需要进行大规模人群研究来验证。另外，本研究发现VCI患者血清hsCRP水平明显高于对照组，提示由于hsCRP可通过促炎及促血栓形成等导致血管内膜损伤、血管痉挛收缩及不稳定斑块脱落，最终加重管腔狭窄闭塞，破坏额叶皮质下环路的完整性，导致认知功能障碍的发生。

总之，通过研究rs1800947(1059G/C)基因多态性和hsCRP与VCI易感性之间的联系，可明确基因-蛋白质-疾病之间的关联，有助于对VCI进行危险分层和临床干预，并根据患者疾病多态性的基因型，解释疾病的可能病因和临床表现，早期筛查并预测疾病的预后。另外，hsCRP毕竟是一个非特异性炎症指标，还有待进一步排除其他因素如吸烟、饮酒、肿瘤、高同型半胱氨酸血症等疾病参与。因本研究为断面研究，样本量较少，尚需进一步进行多中心、大样本的临床研究。