常见SPF级小鼠和大鼠肠道菌群多样性研究

黄树武，闵凡贵，王静，潘金春

(广东省实验动物监测所，广东省实验动物重点实验室 广东广州 510663)

据统计，人体携带的正常微生物达1014个，胃肠道菌群占人体总微生物量的78%[1]。胃肠道作为人和动物体最庞大而复杂的生物群落，正常情况下肠道菌群保持着共生和拮抗的关系，从消化、营养吸收、能量供应、脂肪代谢、免疫调节、药物代谢和毒性等诸多方面影响人和动物的健康状况[2]。

在实验动物中，以小鼠、大鼠为主的啮齿类实验动物占据主要地位，2015年其使用量合计约占实验动物使用总量的74%[3]。目前已经有相关研究开展小鼠和大鼠的肠道菌群与心血管疾病、代谢性疾病、病原感染等疾病的关系[4-5]，肠道菌群代谢产物研究，肠道菌群多样性影响因素研究[6]等，但实验大小鼠常用品系肠道微生态情况研究尚不够充分，且研究方法多采用培养法、扩增核糖体DNA限制性分析、PCR-DGGE电泳等传统方法，导致结果差异较大。

本研究采用新一代Illumina Miseq测序技术及生物信息学分析手段，对常用的实验小鼠和大鼠开展肠道菌群多样性分析，可以全面、平行分析多个样本中的微生物群落信息，从而掌握常用小鼠和大鼠肠道菌群多样性背景，其数据易于分享和比对，解决目前研究中存在的不足，为微生态与相关疾病、代谢产物、药物筛选和评价等相关研究提供基础性资料，以及在选择肠道微生态研究用模型动物时提供参考依据，对促进生物医学的发展有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级小鼠和大鼠来自广东地区三家实验动物生产单位，三个生产单位分别用代号DJ【生产许可证号：SCXK(粤)2018-0044】、ZY【生产许可证号：SCXK(粤)2018-0034】、SY【生产许可证号：SCXK(粤)2018-0002】表示，动物包括小鼠品系C57BL/6、ICR、BALB/c和大鼠品系Wistar、SD，具体信息见表1。

表1 SPF级小鼠和大鼠的信息Table 1 Information of the SPF grade laboratory animals

1.1.2 仪器与试剂

仪器为FTC-3000TM实时荧光定量 PCR仪。试剂为QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒购自QIAGEN公司；AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；PCR反应所用试剂 10× PCR缓冲液、4x dNTP、Taq酶、DL-2000 marker、蛋白酶K，琼脂糖(电泳级)，pMDl9-T载体、T4 DNA连接酶、Tax/Plus聚合酶等均购自宝生物工程(大连)有限公司，其余试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 样品采集

采用 CO2吸入法对动物进行麻醉，再用颈椎脱臼的方法实施安乐死，动物安乐死后解剖取盲肠内容物约1 g，实验操作在广东省实验动物监测所实验设施【使用许可证编号：SYXK(粤)2016-0122】，所有操作符合动物福利和伦理要求。

1.2.2 DNA文库制备与高通量测序

使用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒抽提样品基因组DNA。根据细菌16S rDNA V4-V5区域设计特异引物序列，构建目标区域和带有“5’Miseq接头-barcode-测序引物-特异引物-3’”的融合引物。采用两步PCR扩增的方法构建NDA文库(引物序列见表2)，首先采用内侧引物扩增目的片段，后将目的片段使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行胶回收，而后将回收产物作为模板采用外侧引物进行二次PCR扩增，并使用FTC-3000TMreal-time PCR仪进行定量，均一化混匀后文库制备结束，采用Illumina Miseq 2× 300 bp 高通量测序平台对回收产物进行测序分析。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.2.3 生物信息学分析

Miseq测序原始序列用Trimmomatic和FLASH软件进行质控、过滤、拼接，再用 Mothur软件处理去除错误序列、重复序列以获得优化序列，优化序列用USEARCH和Mothur软件进行运算分类单位(operational taxonomic units，OTU)聚类分析(在97%的相似性水平下划分)和物种分类学分析，基于OTU聚类分析结果，再用Mothur软件和R语言进行Alpha对样品微生物群落的丰度和多样性进行分析；基于分类学信息，可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析，并对样本之间进行Beta多样性分析，并绘制图表。

2 结果

2.1 序列优化及统计

22个样品进行处理共获得696 394个优化序列，平均每个样品31 000多个序列。这些序列在97%的相似水平下聚类获得OTU，平均每个样品获得151个OTU，但样品间数量差异较大，其中来源DJ的OTU平均为253个，来源SY的OTU平均为310个，来源ZY的OTU数量较少，平均为53个。

2.2 OTU聚类分析

为验证样品的测序深度，从样品中随机抽取一定数量的个体，以个体数与物种数来构建稀释性曲线(rarefaction curves)，结果显示所有样品的曲线都趋于平缓(图1)，说明本次测序的数据量合理，能够覆盖样本的绝大部分微生物。

图1 稀释性曲线Figure 1 Rarefaction curves

分别用Jaccard 法和Bray-Cutis 法计算样品之间的差异性，并采用UPGAM法绘制树形图(图2)。结果显示，同一设施来源的动物菌群组成相似性较高；且来源于相同设施的同一品系动物之间存在一定相似性，如DJ-1 ～ DJ-3、DJ-11 ～ DJ-14、SY-1 ～ SY-3等。

注：A.矩阵热图(Jaccard法)；B.矩阵热图(Bray-Cutis法)；C.树状图(Jaccard法)；D. 树状图(Bray-Cutis法)图2 多样本相似性分析Note. A. Matrix heat map (Jaccard). B. Matrix heat map (Bray-Cutis). C. Tree pattern (Jaccard). D. Tree pattern (Bray-Cutis).Figure 2 Multi-sample similarity analysis

2.3 物种信息分析

从门水平聚类分析，小鼠、大鼠肠道菌群主要分成拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、无壁菌门(Tenericutes)、放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)八个门(图3A)，其中拟杆菌门、厚壁菌门占据主要地位，二者合计所占比例达到85%以上。从来源来看，菌群组成略有差异，来源DJ的动物缺少放线菌门和梭杆菌门，来源ZY的动物缺少放线菌门，来源SY的动物缺少梭杆菌门。品种品系也存在差异，小鼠没有放线菌门，大鼠没有梭杆菌门，ICR小鼠还没有梭杆菌门，Wistar大鼠还没有放线菌门。从聚类结果看，来源SY和ZY的相似性较高。

从属水平聚类分析，除未分类的细菌外，小鼠、大鼠肠道菌群共分成63个属，其中比例最高的是拟杆菌属(Bacteroides)，平均约占40%。其次较多的属包括Hungatella、副杆状菌属(Parabacteroides)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、Mucispirillum、Ruminiclostridium、Akkermansia、罗氏菌属(Roseburia)等(图3B)。从品种、品系比较看，主要优势菌属组成都较接近，部分品种、品系可能缺乏一些低丰度的菌属，如大鼠未检到巨单胞菌属(Megamonas)、Papillibacter、Catenibacterium、梭菌属(Fusobacterium)等4种菌属，小鼠未检到Romboutsia、Butyricimonas、Adlercreutzia、变形杆菌属(Proteus)、Faecalibaculum、Allobaculum、Arenimonas、Gordonibacter等8种菌属。从聚类结果看，来源DJ和SY的相似性较高。

图3 门(A)与属(B)水平聚类树与柱状图组合分析结果Figure 3 Results of cluster tree and histogram combination analysis on phylum(A) and genus(B) levels

图4 Alpha多样性分析Figure 4 Alpha diversity analysis

2.4 Alpha多样性分析

通过单样品的多样性分析(Alpha 多样性)可以反映微生物群落的丰度和多样性，估计环境群落的物种丰度和多样性。本次样品文库的平均覆盖率(coverage指数)为99.91%，反应本次测序深度能代表样品的真实情况。根据香农指数、辛普森指数、Chao指数和Ace指数结果(图4)，总体来看来源于DJ、SY的动物物种丰富度差不多，都高于来自ZY动物的物种。

2.5 Beta多样性分析

PCoA(principal co-ordinates analysis)是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，通过PCoA分析可以观察个体或群体间的差异。本研究的PCoA分析显示来源于DJ、SY、ZY的动物分成了三个群落，且在考虑序列丰度的情况下更为明显(图5)。通过Unifrac分析制作差异性矩阵热图(图6)，在不考虑序列丰度的情况下(weighted unifrac)，结果显示与上述差异性分析结果略有差异，来源SY与ZY的动物菌群差异更小一点；而在考虑序列丰度的情况下(unweighted unifrac)，结果显示与上述差异性分析结果一致，相同来源动物的肠道菌群差异较小，同时来源于DJ、SY动物之间肠道菌群的相似性较高，且DJ、SY动物品系也对肠道菌群的相似性有所影响。

图5 PCoA分析Figure 5 PCoA analysis

图6 差异性矩阵热图Figure 6 Differential matrix heat map

3 讨论

微生物的多样性及结构研究是进行复杂微生态系分析的基础，通过分析实验动物肠道中微生物的丰度与结构，能够揭示实验动物肠道疾病发生与微生物群落之间的关系，从而为预防和治疗肠道疾病提供合理的理论依据[7]。

早期的研究实验小鼠肠道正常菌群主要菌属有双歧杆菌、拟杆菌(类杆菌)、肠球菌、乳杆菌、梭杆菌、真杆菌[8]。随着高通量测序技术的发展与应用，本研究中实验小鼠、大鼠肠道菌群共分成63个属，其中拟杆菌属的含量最高，其次为Hungatella、副杆状菌属、乳酸杆菌属、Mucispirillum、Ruminiclostridium、Akkermansia、罗氏菌属。而在人肠道中较为常见的柔嫩梭菌属、真杆菌属等菌属在本研究小鼠、大鼠肠道中并未发现[9]。李伟等[10]对实验小鼠和大鼠肠道总菌群进行多样性比较研究，结果显示种间肠道菌群存在差异，种内雌雄个体之间并没有显著的差异，与本研究中同种品系雌雄间肠道菌群无明显差别一致。

从门水平看，实验小鼠和大鼠肠道菌群以拟杆菌门和厚壁菌门占据主要地位，其次为脱铁杆菌门、变形菌门、疣微菌门、无壁菌门、放线菌门和梭杆菌门；大小鼠与人肠道菌群相比较则存在多数门交叉，总体组成较为接近，都以硬壁菌门和拟杆菌门占据优势；但也有部分门不相同，如小鼠和大鼠有脱铁杆菌门和无壁菌门，人有蓝菌门、螺旋体门和Vadin BE97门[11]。最近有对树鼩大肠菌群的研究显示，树鼩的肠道菌群同样具有丰富的多样性，以厚壁菌门和变形菌门的丰度最高[12]。也有研究表明不同饮食对同一鼠种肠道菌群多样性存在差异，同种饮食干预对不同品系鼠种肠道菌群多样性的影响也存在差异，但不同饮食结构的大小鼠均以拟杆菌门和厚壁菌门为主要优势菌群[6]。

本研究结果显示，不同来源设施对动物肠道菌群多样性的影响较大， Alpha多样性分析显示ZY的物种丰富度明显低于DJ和SY，Beta多样性分析也说明相同来源动物的菌群组成相似性较高；同时品系对菌群相似性也有所影响，如DJ-1～DJ-3、DJ-11～DJ-14、SY-1～SY-3品系内相似度较高。因此，不同来源设施的饲养环境是动物肠道菌群多样性的主要影响因素，品系对肠道菌群多样性也有一定影响。