泼尼松龙致不同品系小鼠药源性证候的比较

2019-04-28钱宏梁潘志强彭佩克卢涛钱杨杨宋秋佳费敏红方肇勤

中国实验动物学报 2019年2期

钱宏梁，潘志强，彭佩克，卢涛，钱杨杨，宋秋佳，费敏红，方肇勤

(上海中医药大学基础医学院，上海 201203)

证候动物模型是中医证候基础学研究的重要内容。在开展证候动物模型时究竟选择哪种品种与品系，是研究者首要取舍的问题，基于此，本文在课题组既往大量的小鼠证候研究基础上[1-2]，比较常用5种品系小鼠对糖皮质激素药物泼尼松龙的反应，以明确最适合作为糖皮质激素药源性证候的实验小鼠，为后续建立“糖皮质激素药源性证候模型标准化方法与评价体系”奠定基础。

糖皮质激素是一种类固醇激素，生理上发挥不可或缺作用，而机体在多种病理状态下需要补充外源性糖皮质激素药物以发挥抗病作用。值得注意的是，大剂量或长期使用糖皮质激素药物不可避免产生一系列不良反应，从中医学理论上分析可以辨证相关的证候，称之为糖皮质激素导致的“药源性证候”[3]。本研究以0.5 mg/(kg·d)泼尼松龙连续灌胃5种小鼠14 d后，观察其对不同品系小鼠的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性ICR、BALB/c、C57BL/6J和BALB/c裸小鼠共64只，SPF级，5周龄，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司【SCXK(沪)2013-0016】；雄性KM小鼠16只，SPF级，20～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2016-0011】。小鼠均饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级动物房【SYXK (沪) 2014-0008】。实验伦理声明：本设施的环境条件符合中国国家标准《实验动物环境及设施》(GB14925-2001)对普通动物实验设施的有关标准，动物饲养管理和动物实验操作符合《实验动物管理条例》。实验动物伦理委员会批准号SZY201803011。

1.1.2 药物与试剂

醋酸泼尼松龙片(国药准字H31020771)，购自上海上药信谊药厂有限公司。TRIzol购自Invitrogen公司。PrimeScript®RT reagent Kit、SYBR® Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)II购自TaKaRa公司。采用Primer3(v.0.4.0)在线软件设计引物，见表1，并委托Life Technologies公司合成。皮质酮ELISA试剂盒(货号501320)购自美国Cayman公司，促肾上腺皮质激素(ACTH)ELISA试剂盒 (货号M046006)购自美国Mdb公司。LDL Receptor抗体 (ab52818)、SR-BI抗体 (ab52629)、StAR抗体(ab96637)均购自美国Abcam公司。β-actin抗体(货号A5441)购自Sigma-Aldrich公司。

表1 小鼠肾上腺皮质功能基因Table 1 Genes of adrenal cortical function in the mice

1.1.3 实验设备

四诊设备：YLS-13 A型小鼠抓力测定仪(购自山东省医学科学院设备站)，底部划有5 cm×5 cm方格(3行×5列=15格)的实验笼，ThermaCAM P30型红外热像仪器(购自美国FLIR公司)。QuantStudioTM3实时荧光定量PCR仪(美国Thermo公司)，Elx800型酶标仪(美国Biotek公司)，Alpha化学发光凝胶成像系统(Protein-Simple公司)等。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模

小鼠适应性饲养后，ICR、BALB/c、C57BL/6J、KM和裸鼠均随机分为2组：正常对照组(n=8)，泼尼松龙组(n=8)。泼尼松龙组灌胃0.5 mg/(kg·d)泼尼松龙(此剂量则是根据临床常用量每日30 mg/kg 折算到小鼠所得)，每日1次；正常对照组灌胃等体积的灭菌水。

1.2.2 四诊指标观测

在实验第14天，运用小鼠辨证论治实验方法学采集小鼠四诊信息：一般外观表现、体重、躯体不同部位红外温度、旷场实验活动度(计算方法：在网格中活动60 s的跨格数以及前肢离地次数的总和)、四肢抓力、腋温等表征信息，然后进行计量化辨证。具体参见有关文献[1,4-6]。

1.2.3 取材

在实验第15天处死小鼠，先称体重，取材如下：

(1)眼球取血，分离血清，检测皮质酮与ACTH含量。

(2)脾、胸腺称取重量并计算脏器指数。脾指数=脾重量(mg)/体重(g)。

(3)取肾上腺组织检测Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1、Cyp11b2的mRNA表达，以及LDLR、SRBI、StAR蛋白表达。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测基因mRNA表达

按照TRIzol试剂盒说明书抽提肾上腺总RNA；逆转录反应体系20 μL，反应条件为37℃×15 min，85℃×5 s，4℃；PCR扩增反应体系为20 μL，反应程序为95℃×3 min，95℃×5 s，60℃×30 s，40个循环。基因相对表达量分析方法：采用2-ΔΔCT法分析。

1.2.5 ELISA检测血清激素

依据ELISA试剂盒说明书操作，用血清样本检测皮质酮和ACTH含量。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达

采用RIPA裂解液处理肾上腺组织，提取蛋白质样品并定量，通过变性后，分别执行聚丙烯凝胶电泳、转膜、封闭、一抗孵育、洗涤、二抗孵育、再洗涤、显影等常规实验流程，其中，一抗浓度内参β-actin以1∶20000稀释，LDLR抗体以1∶5000稀释，SRBI、StAR抗体均以1∶2000稀释。

1.2.7 数据分析

采用GraphPad Prism7.0专业软件进行作图、及统计分析。

2 结果

2.1 小鼠四诊指标

2.1.1 体重动态变化(阴盛衰程度)

与各自正常对照组比较，给药泼尼松龙后小鼠体重均出现增长减缓。其中，给药后第7天起，ICR小鼠体重显著下降(P<0.01)；给药后第13天起BALB/c小鼠体重显著下降(P<0.01)；给药后第5天起C57BL/6J小鼠体重显著下降(P<0.01)；给药后第13天裸鼠体重显著下降(P<0.05)，见图1。

注：a为ICR小鼠，b为BALB/c小鼠，c为C57BL/6J小鼠，d为KM小鼠，e为裸鼠。与各自的正常对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。(下图同)。图1 体重动态变化Note. a：ICR mice; b：BALB/c mice; c：C57BL/6J mice; d：KM mice; e：nude mice. Compared with their normal control groups,* P<0.05,**P<0.01. (The same in the following figures)Figure 1 Dynamic changes of body weight

2.1.2 旷场活动度、抓力差异(气盛衰程度)

与正常对照组比较，泼尼松龙给药后5种小鼠抓力均有一定下降，其中泼尼松龙给药后ICR小鼠抓力显著下降(P<0.05)，见图2。

2.1.3 不同部位红外温度、腋温差异(阳盛衰程度)

与正常对照组比较，泼尼松龙给药后ICR小鼠腋温、头部最高温度、躯干平均温度、尾部最低温度均有一定下降，其中躯干平均温度显著下降(P<0.01)。其他小鼠不同部位红外温度、腋温均有一定程度下降但未出现统计学差异，见图2。

注：a为小鼠抓力，b为小鼠旷场活动度，c为小鼠腋温，d为头部最高温度，e为躯干平均温度，f为尾部最低温度。图2 四诊指标变化Note.a, Holding power. b, Activity degree of open field. c, The axillary temperature. d, The highest temperature of head. e, The average temperature of body trunk. f: The lowest temperature of tail.Figure 2 Changes of four diagnostic indexes

2.2 小鼠脏器变化

2.2.1 脾重量及指数

与正常对照组比较，泼尼松龙给药后5种小鼠脾重量指数均出现下降，其中，ICR和裸鼠的脾重量显著下降(P<0.01)，裸鼠脾指数显著下降(P<0.05)，见图3。

2.2.2 胸腺重量及指数

与正常对照组比较，泼尼松龙组小鼠胸腺重量指数均出现下降。其中，ICR、C57BL/6J和KM胸腺重量指数显著下降(P<0.01)，BALB/c泼尼松龙组胸腺重量指数变化不明显，见图3。此外裸鼠免疫缺陷故无胸腺。

图3 泼尼松龙对小鼠脾、胸腺重量以及指数影响Figure 3 Effects of prednisolone on the mass and index of mouse spleen and thymus

2.3 血清皮质酮与促肾上腺皮质激素(ACTH)含量

与正常对照组比较，BALB/c的血清皮质酮与ACTH含量下降显著(P<0.05或P<0.01)；KM血清皮质酮含量下降显著(P<0.01)，见图4。

图4 血清皮质酮与ACTH水平变化Figure 4 Changes of serum corticosterone and ACTH

2.4 肾上腺类固醇激素合成酶的基因表达

类固醇合成急性调节蛋白(Star)、胆固醇侧链裂解酶(Cyp11a1)、21-羟化酶(Cyp21a1)、11β-羟化酶1(Cyp11b1)和11β-羟化酶2(Cyp11b2)是肾上腺皮质细胞肾上腺类固醇激素合成过程中的重要酶。

如图5所示，与正常对照组比较，ICR小鼠的Cyp21a1基因显著下调(P<0.05)；裸鼠的Star基因表达显著下调(P<0.05)，Cyp21a1基因表达显著下调(P<0.01)。

与正常对照组比较，C57BL/6J泼尼松龙组小鼠Star基因表达显著下调(P<0.01)。

与正常对照组比较，KM泼尼松龙组小鼠Cyp11a1、Cyp21a1基因显著下调60%～70%(P<0.01)。

总体分析，0.5 mg/(kg·d)泼尼松龙对BALB/c、C57BL/6J小鼠的肾上腺功能抑制程度较轻，而对KM小鼠的抑制程度较强。泼尼松龙对ICR小鼠肾上腺合成类固醇激素过程的相关基因均出现抑制且抑制程度在10%～30%之间较为稳定。

2.5 肾上腺类固醇激素合成相关蛋白表达

如图6所示，与正常对照组比较，泼尼松龙显著抑制ICR小鼠肾上腺LDLR蛋白表达、StAR蛋白表达有所下降。泼尼松龙显著抑制KM小鼠肾上腺StAR蛋白表达。然而，泼尼松龙给药后BALB/c、C57BL/6J以及裸鼠的肾上腺LDLR、SRBI、StAR蛋白表达未呈现显著变化。

注： a.正常对照组；b.泼尼松龙组。图6 小鼠肾上腺类固醇激素合成蛋白表达Note. a, Normal control group. b, Prednisolone group.Figure 6 Expression of adrenal steroid synthetic protein

低密度脂蛋白受体(LDLR)是一种细胞表面糖蛋白在胆固醇代谢中起关键作用[7]。而B族I型清道夫受体(SR-BI)是高密度脂蛋白的受体[8]。类固醇合成急性调节蛋白(StAR)是胆固醇的一种转运蛋白对合成类固醇激素有调节作用[9]。

从以上肾上腺蛋白表达的变化来看，0.5 mg/(kg·d)泼尼松龙对于ICR和KM小鼠肾上腺摄取胆固醇以及将胆固醇转化为肾上腺皮质激素过程有一定抑制作用。

3 讨论

3.1 泼尼松龙的毒理呈现的类似中医证候

泼尼松龙是临床常用的糖皮质激素药物，具有抗炎、免疫抑制、抗休克、抗毒等药效[10]。泼尼松龙常见的不良反应包括①大剂量给药后可能出现全身性的过敏反应、各种细菌真菌和疱疹病毒感染，还有面部、鼻黏膜及眼睑肿胀，荨麻疹，气短，胸闷，喘鸣等症状。推测中医证候以火毒壅盛、阳浮阴弱、上盛下虚为主。②长程用药可引起医源性柯兴综合征面容和体态、体重增加、下肢浮肿、骨质疏松或骨折、肌无力、消化性溃疡或肠穿孔，儿童生长受到抑制和肾上腺轴功能减退。推测中医证候以脾肾两脏的阳气虚衰、水湿壅盛为主。③停药后出现血压偏低、头晕、头疼、昏厥倾向、腹痛或背痛、低热、食欲减退、恶心、呕吐、肌肉或关节疼痛、乏力、软弱。推测中医证候以全身性的气虚和阴阳两虚为主。

总之，泼尼松龙短时间引起的证候主要以阴虚火旺为主，长时间引起的证候主要阳、气虚衰及肾虚为主。本实验通过小鼠辨证论治实验方法学评估小鼠的气、阴、阳三个方面的盛衰。结果表明，小鼠体重下降阴虚见证显著于临床表现类似。小鼠肾上腺功能下降、脾和胸腺萎缩出现肾虚、气虚见证显著，临床相关表现为骨质疏松或骨折、肌无力、乏力、软弱等常见症状。

3.2 泼尼松龙诱导药源性证候特征及其肾上腺皮质抑制差异

基于实验小鼠品系的多样性，为探索不同品系小鼠对同一药物作用及其耐受性的差异性，本研究选用目前常用的ICR、BALB/c、C57BL/6J、KM和裸小鼠共5种品系小鼠为受试对象，采用临床常用的糖皮质激素药物泼尼松龙灌胃小鼠，然后运用本课题组研究与创建的“实验大鼠/小鼠四诊与辨证方法学”对小鼠证候进行评估[1,6]。

体重下降提示机体物质基础的减少，体重是中医“阴”盛衰程度的重要评价指标。小鼠旷场活动度和抓力体现机体的“气”的盛衰程度。体温可以最直观地体现机体的阳热程度。脾和胸腺的免疫功能强弱与中医“气”盛衰程度有密切关系。血清皮质酮、ACTH含量、肾上腺类固醇激素合成酶基因变化以及此过程相关的蛋白是评价中医“肾”功能的分子指标。结果发现，从小鼠四诊相关指标来看，0.5 mg/(kg·d)泼尼松龙造成5种小鼠体重增长减缓或下降，其中，KM、BALB/c和裸鼠体重变化相对较小，而对ICR和C57BL/6J的体重影响较大。泼尼松龙给药后ICR小鼠出现一定程度的气虚和阳虚见证，KM小鼠出现体温下降趋势类似阳虚见证，而其他品系小鼠“气”和“阳”的盛衰程度变化不显著。

深入探索泼尼松龙诱发药源性证候的内在物质基础及其功能变化，发现0.5 mg/(kg·d)泼尼松龙造成ICR和裸鼠的脾显著萎缩以及ICR、C57BL/6J、KM和裸鼠的胸腺显著萎缩，而BALB/c小鼠脾和胸腺变化均不明显。从生化指标上看，泼尼松龙造成BALB/c小鼠血清皮质酮与ACTH含量下降，相对其他品系小鼠最显著。此外，泼尼松龙对BALB/c、C57BL/6J小鼠的肾上腺合成类固醇激素过程的相关基因和蛋白抑制程度较小，而对KM小鼠抑制程度相对较强，对ICR小鼠相对较稳定。

由于泼尼松龙药理毒理作用广泛，王火等[10]发现甲基泼尼松龙可导致长期肾上腺皮质功能抑制，与使用剂量有关。此外，有临床观察发现6.8 g/d泼尼松临床用量有增加骨质疏松的风险[11]。基于此，国内外学术界有大量关于运用泼尼松龙制作骨质疏松疾病模型的研究[12]，发现泼尼松龙具有导致机体肾藏象亏虚的现象，与本研究结论相似，然而既往文献缺乏对其分子机制的深入认识，本研究发现，提示0.5 mg/(kg·d)剂量的泼尼松龙抑制小鼠体重增长，造成脾和胸腺的萎缩抑制免疫系统功能，抑制垂体-肾上腺皮质轴功能，从而呈现类似临床的“肾虚”或“脾虚”为主的全身性虚弱证候。这有助于从肾上腺皮质轴分子功能层面深入揭示泼尼松龙所致的小鼠药源性证候内涵。