大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR检测方法的建立与应用

孟钰榕，郑龙，祝岩波，王璇，尤红煜，刘健敏，栗彦宁，连伟光， 张东明，王俊霞*

(1. 河北省实验动物重点实验室，河北医科大学实验动物学部，石家庄 050000； 2. 河北医科大学第二医院，石家庄 050000)

仙台病毒(Sendai virus，SeV)，乙型副流感病毒，属副黏病毒属，为单股负链RNA病毒，基因组全长15384 bp，编码6个结构蛋白(L，P，NP，HN，F，M)和一个非结构蛋白C，其基因排列次序为：3’-Leader-NP-P+C-M-F-HN-L-Leader-5’[1]。传染性强，容易扩散，是啮齿类实验动物最难控制的病毒之一。易引起小鼠和大鼠继发感染，主要表现呼吸道症状，多数呈隐性感染，对实验研究产生严重干扰[2-3]。

大鼠冠状病毒(Rat coronavirus，RCV)，属冠状病毒科，冠状病毒属，是一种高度接触传染性病毒。冠状病毒基因组的基本结构是5’-UTR-ORFlab-(HE)-S-E-M-N-3’UTR，RNA链5’端有甲基化的帽子结构，3’末端有PolyA尾结构[4]。大鼠冠状病毒易引起大鼠发生呼吸道和肺部炎症，新生大鼠最易感，病死率较高[5]。

我国实验动物国家标准GB14922.2-2011中规定的SPF级大鼠必须排除7种病毒，其中包括仙台病毒和大鼠冠状病毒。国内病毒感染诊断方法主要是针对抗体检测的血清学方法，但由于免疫缺陷大小鼠不能产生抗体反应，所以抗体检测不能用于免疫缺陷大小鼠[6-7]。因此，本研究旨在针对上述两种病毒建立快速高效的双重PCR检测方法，为及时准确地监控病毒感染提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

实验动物临床样本包括：(1)人工感染仙台病毒组织DNA样本30份(广东省实验动物监测所惠赠)；(2)实验动物肺组织样本94份，其中SPF级SD大鼠36只(120 ～ 140 g)，清洁级SD大鼠10只(120～140 g)，SPF级KM小鼠24份(18 ～ 20 g)、清洁级豚鼠5份(180 ～ 200 g)、普通级家兔19份(2.5 kg)。实验动物来源于河北省实验动物中心、河南省实验动物中心、山西医科大学和望都县彤辉养殖有限公司，均具有实验动物生产许可证。取样在河北医科大学实验动物学部P2实验室进行【SYXK(冀)2013-0026】。

1.1.2 病毒、细胞株

仙台病毒(SeV, ATCC VR-105)、大鼠冠状病毒(RCV, ATCC VR-1410)购自美国典型微生物菌种保藏中心；小鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus，MHV)、小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型(reovirus type 3，Reo-3)、小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice，PVM)、大鼠细小病毒KRV株(Kilham rat virus，KRV)、大鼠细小病毒H-1株(Toolan virus，H-1)由广东省实验动物监测所惠赠，细胞BHK21由中国食品药品检定研究院惠赠。

1.1.3 引物

根据仙台病毒和大鼠冠状病毒保守特异区域设计相应引物,引物基因、引物序列、产物长度和参考文献见表1。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.1.4 试剂和仪器

Gold Multiplex PCR Mix、SuperRT cDNA Synthesis Kit(康为世纪有限公司)，DNA Ladder(南京诺睢赞生物科技有限公司)，琼脂糖Agarose(Biowest公司)，Tris和胎牛血清(北京索莱宝科技有限公司)，核酸染料ExRed(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)，TRIzol(天根生化科技有限公司)，1640培养基(上海立菲生物技术有限公司)，SeV和RCV ELISA试剂盒(中国食品药品检定研究院)。

微量分光光度计(基因公司NanoDrop)；PCR仪(美国ABI 9700)；凝胶成像系统(美国UVPGDS-8000)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2 方法

1.2.1 病毒培养

BHK21细胞在含10%胎牛血清的1640培养基中按1∶3的比例传代培养。贴壁细胞达80% ～ 90%时弃培养液，加入100 μL的病毒原液，37℃培养1 h，每20 min混匀一次，最后加入4 mL 1640培养基，直至细胞融合达到80%以上，收集病毒, -80℃保存[9]。

1.2.2 标准毒株和肺组织样品RNA的抽提

按TRIzol操作说明书进行。

1.2.3 RNA逆转录为cDNA

按SuperRT cDNA Synthesis Kit试剂说明进行。

1.2.4 双重PCR反应体系和反应条件

PCR反应体系为50 μL，包括Mix 25 μL，SeV上游和下游混合引物0.72 μL(终浓度为0.072 μmol/L)，RCV 上游和下游混合引物1.24 μL(终浓度为0.124 μmol/L)，SeV和RCV DNA各1 μL(1×104copies)，补水至50 μL。

反应条件[10]为95℃ 5 min；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，共3个循环；95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环；72℃ 7 min。10 μL扩增产物，2.5%琼脂糖凝胶电泳，120 V电泳35 min。

1.2.5 PCR扩增产物测序

PCR产物直接由Invitrogen完成纯化及测序工作，测序结果于NCBI利用核酸BLAST功能进行同源序列比对。

1.2.6 特异性试验

用建立的双重PCR体系分别对KRV、H-1、MHV、Reo、PVM、兔、小鼠、大鼠、豚鼠肺组织进行检测，验证该方法的特异性。

1.2.7 敏感性试验

将病毒的阳性质控品做2倍系列稀释，取1 μL作为PCR反应模板，检验双重PCR的敏感性。

1.2.8 动物样本的检测

用建立的双重PCR体系分别扩增94份实验动物肺组织样本和30份人工感染仙台病毒组织DNA样本。

2 结果

2.1 双重PCR方法的建立及优化

分别对仙台病毒和大鼠冠状病毒进行PCR实验，结果显示仙台病毒扩增出262 bp产物，大鼠冠状病毒扩增出168 bp产物(见图1A)。按照1.2.4反应条件进行双重PCR体系优化，当RCV引物浓度为0.124 μmol/L时，比较SeV引物浓度分别为0.054 μmol/L，0.063 μmol/L，0.072 μmol/L，0.081 μmol/L时扩增效果，结果显示SeV引物浓度为0.072 μmol/L时，两条扩增条带均一清晰(见图1B)。将单重PCR产物进行测序，在Genbank中Blast对比，仙台病毒和大鼠冠状病毒同源性分别为100%和99%(图2)。

2.2 特异性试验

采用建立的双重PCR方法对KRV、H-1、MHV、Reo、PVM、兔、KM小鼠、SD大鼠、豚鼠肺组织进行检测，验证该方法的特异性。结果除阳性对照和MHV为阳性外，其他病毒及组织均为阴性，且不存在交叉反应。将MHV扩增产物进行测序，在Genbank中BLAST对比(见图3、图4)。

注：A：M,100 bp DNA ladder；Lane 1, 仙台病毒PCR；Lane 2, 大鼠冠状病毒PCR；Lane 3, 仙台病毒和大鼠冠状病毒双重PCR；Lane 4, 双重PCR(阴性对照)。B：M.100 bp DNA ladder；Lanes 1-4 大鼠冠状病毒引物终浓度均为0.124 μmol/L，仙台病毒引物终浓度分别为0.054，0.063，0.072，0.081 μmol/L；Lane 5.阴性对照。图1 双重PCR体系的建立及优化Note. A. M, 100 bp DNA ladder. Lane 1, Sendai virus PCR. Lane 2, Rat coronavirus PCR. Lane 3, Duplex PCR of SeV and RCV. Lane 4, Duplex PCR (negative control). B. M, 100 bp DNA ladder. Lanes 1-4, Primer concentration of Rat coronavirus was 0.124 μmol/L, Primer concentrations of Sendai virus were 0.054, 0.063, 0.072, 0.081 μmol/L, respectively. 5. Negative control.Figure 1 Establishment and optimization of the duplex PCR assay

图2 单重PCR产物BLAST序列对比结果Figure 2 Results of BLAST sequence comparison of single PCR products

注：M, 100 bp DNA ladder；Lane 1, 阳性对照；Lane 2, 阴性对照；Lane 3, 大鼠细小病毒KRV株；Lane 4, 大鼠细小病毒H-1株；Lane 5, 小鼠肝炎病毒； Lane 6, 小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型；Lane 7, 小鼠肺炎病毒；Lanes 8-11分别为兔、KM小鼠、SD大鼠、豚鼠肺样本。图3 特异性实验结果Note. M, 100 bp DNA ladder. Lane 1, Positive control. Lane 2, Negative control. Lane 3, Kilham rat virus. Lane 4, Toolan virus, H-1. Lane 5, Murine hepatitis virus. Lane 6, Reovirus type 3. Lane 7, Pneumonia virus of mice. Lanes 8-11, Lung samples from rabbits, KM mice, SD rats, and guinea pigs, respectively.Figure 3 Results of the specificity test

2.3 敏感性试验

将病毒的阳性质控品做2倍系列稀释，得到系列标准模板。利用优化后的反应体系和条件进行双重PCR检测。结果显示SeV、RCV的检测下限为1.56 × 102copies/μL(见图5)。

2.4 双重PCR检测方法在动物样本检测中的初步应用

2.4.1 双重PCR方法在仙台病毒人工感染样本检测中的初步应用

应用双重PCR方法对30份人工感染SeV组织DNA样本进行检测，阳性核酸样本均被检出,与预期结果一致(图6)。

2.4.2 双重PCR方法在实验动物临床样本检测中的初步应用

应用双重PCR体系分别对94份实验动物肺组织样本进行检测，结果未检出SeV、RCV(见图7)。

3 讨论

图4 MHV扩增产物序列比对结果Figure 4 Results of sequence comparison of the MHV amplification products

注：M: 100 bp DNA ladder；Lane 1, 阳性对照；Lane 2, 阴性对照；Lanes 3-8, 人工感染仙台病毒组织DNA样本。图6 人工感染SeV组织DNA样本结果Note. M, 100 bp DNA ladder. Lane 1, Positive control. Lane 2, Negative control. Lanes 3-8, DNA samples of Sendai virus infected artificially.Figure 6 Results of DNA samples from artificially SeV-infected tissues

注：M: 100 bp DNA ladder；Lane 1, 阳性对照；Lane 2, 阴性对照；Lanes 3-8, 小鼠肺组织；Lanes 9-17,大鼠肺组织。图7 双重PCR检测实验动物标本Note. M. 100 bp DNA ladder. Lane 1, Positive control. Lane 2, Negative control. Lanes 3-8, The lung tissues of mice. Lanes 9-17, The lung tissues of rats.Figure 7 Results of the duplex-PCR detection of laboratory animal specimens

双重PCR技术广泛应用于病原微生物检测与鉴定。双重PCR是指将多对引物加入同一个反应体系里，扩增出多个不同大小产物的技术，由于会互相造成干扰，引物之间可能会形成二聚体[11]，所以，引物设计和反应条件的优化是本实验成功的关键。本研究根据已发表文献和基因序列，设计选择仙台病毒和大鼠冠状病毒的多对特异性引物，根据产物大小和引物特征进行两种病毒的引物配对，通过筛选和引物浓度优化，最终确定了两对引物。在PCR反应中，退火温度对PCR的特异性有较大影响，选择合适的退火温度往往需要多次反应, 费时费力，并且即使通过多次试验找到最佳的退火温度后, 在更换其他的PCR仪进行同样的扩增时，最适的退火温度也有可能发生改变, 需要重新确定最佳退火温度[12]。本研究应用touch-down PCR技术，设计多循环反应程序，使相连循环的退火温度逐渐降低。先用高温扩增，保证扩增的特异性,待目的基因的丰度升高后降低退火温度，提高扩增效率。此技术不仅避免了因确定最佳退火温度时的复杂反应优化过程，还使目的产物得到富集。目前touch-down PCR已广泛应用于病毒、细菌、寄生虫的快速检测等。

本研究结合双重PCR技术与touch-down PCR技术，建立仙台病毒和大鼠冠状病毒双重PCR。在双重PCR体系优化过程中，当RCV引物浓度为0.124 μmol/L时，调整SeV引物浓度，在SeV引物浓度为0.072 μmol/L时，两条扩增条带均一清晰。通常的touch-down PCR反应的退火温度范围可跨越15℃左右，在本实验中，由于软件预测的两个退火温度仅相差2℃，将退火温度范围设定在65 ～ 62℃之间，已经达到理想的检测目的。该双重PCR体系敏感性检测结果显示，SV和RCV检测下限均为1.56 × 102copies/μL。应用双重PCR体系扩增KRV、H-1、MHV、Reo、PVM，其中MHV扩增片段与RCV目的条带大小相似，因为小鼠肝炎病毒和大鼠冠状病毒同属于冠状病毒属，DNA序列具有高度同源性。应用双重PCR反应体系扩增人工感染仙台病毒组织DNA样本，30份仙台病毒核酸阳性标本均被检出，与预期结果一致。为验证该体系的应用效果，采集实验动物组织样本94份，用双重PCR体系扩增SeV和RCV病毒，与ELISA检测方法比对结果一致，初步验证了本方法的可行性。本研究旨在当两种病毒混合感染时，双重PCR方法使得混合感染的检测变得简单、方便、快速，大大降低检测成本，为大鼠日常监测、临床诊断和流行病学调查提供实验依据。