三七丹参片急性毒性实验研究

董勇波 ，高明海 ，游晓蕾 ，张兴城，张维清 ，赵 爱*

（1.文山华信三七股份有限公司，文山663099；2.云南省文山学院文山三七研究院，文山663099）

三七为五加科植物，药理作用广泛，具有抗疲劳、耐缺氧、活血化瘀及提高免疫功能等多方面的用。丹参,为唇形科植物丹参的干燥根和根茎，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈之功效。本研究通过小鼠急性毒性实验研究，探讨三七丹参片的毒副作用，为进一步开发新产品提供帮助。

1 实验部分

1.1 样品性状及处理

受试物由文山华信三七股份有限公司出品（北京御生堂保健食品有限公司生产），批号：20170801。送检样品为片剂，常温、干燥、通风保存。进行实验前，将样品经粉碎机粉碎后供实验用。

1.2 实验动物和试剂

1.2.1 实验动物

选浙江省实验动物中心提供的SPF级健康、断乳、体重60～80g的SD大鼠80只，雌雄各半。实验动物生产许可证号为SCXK(浙）2014-0001、实验动物使用许可证号为SYXK(浙)2014-0008。实验动物饲料由浙江省实验动物中心提供。检测环境条件，室温20～25℃,相对湿度范围 40%～70%。

1.2.2 实验试剂

2-乙酰氨基芴：Sigma-A1drich公司，批号STBF2332V；1,8-二羟基蒽醌：Sigma-A1drich 公司，批号WXBC4791V；叠氮钠：北京鼎国生物技术有限责任公司，批号：81G10150；敌克松 Chemservice公司，批号：285-75B；丝裂霉素 C：Roche公司，批号M0308A；环磷酰Sigma-A1drich公司,批号：WXBC5093V。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠急性经口毒性实验：

1.3.1.1 实验动物

选用健康、成熟，体重18～22glCR小鼠20只，雌雄各半。

1.3.1.2 剂量和给药方法

按最大耐受量法设20.0g/kg体重一个剂量组。称取样品20g,以1%羟甲基纤维素钠为溶媒配制成40ml样品液。小鼠灌胃前禁食 （不禁水）16小时，按20ml/kg体重灌胃容量灌胃二次，间隔4小时。末次灌胃2小时后动物自由进食、饮水，记录动物中毒表现及死亡情况。

1.3.1.3 观察指标

灌胃后，观察小鼠的一般状况、中毒表现和死亡情况。观察期限为7天，记录小鼠初期及期末体重。2.3.1.4观察结果：小鼠急性经口毒性实验：小鼠死亡情况见表1。实验期间，各小鼠均未见明显中毒表现，也无死亡。山里有三牌三七丹参片对雌雄小鼠经口MTD均大于20.0 g/kgBW，属无毒级。

表1 山里有三牌三七丹参片小鼠急性毒性死亡情况

1.3.2 Ames实验

1.3.2.1 实验菌株

选用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌，共四株，即 TA97a、TA98、TA100、TA102。 菌株由上海市疾病预防控制中心提供，经生物学鉴定合格后进行实验。

1.3.2.2 剂量选择及阳性对照物：实验采用平板掺入法。称取样品0.50g，以DMSO研磨制成10.0ml样品液，0.103Mpa、实验时以灭菌DMSO梯度稀释至各剂量。用TA100菌株的非代谢活化系统进行预实验，结果在剂量为5000μg/皿时未出现明显的增菌和抑菌现象，故正式实验时选择实验浓度为8、40、200、1000、5000μg/皿五个剂量组，外加空白对照、溶剂对照和阳性对照组（叠氮钠、敌克松、2-乙酰氨基芴、1,8-二羟基蒽醌）。每种菌株每个测试浓度设三皿平行，在加和不加S9条件下进行实验。

1.3.2.3 观察指标

直接计数培养基上各菌株的回变菌落数。

1.3.2.4 结果判定

以计数培养基上回变菌落数的多少而定，如在背景生长良好条件下，受试物组回变菌落数增加一倍以上，并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物Ames实验为阳性。

1.3.2.5 Ames实验结果

各菌株回变菌落数见表2。从实验结果可见，不同浓度受试物在加和不加S9条件下的回变菌落与阴性对照组相近似，而阳性对照组回变菌落数均高于阴性对照组回变菌落数2倍以上。山里有三牌三七丹参片Ames实验检测结果为阴性

表2 山里有三牌三七丹参片Ames实验结果

1.3.3 小鼠骨髓细胞微核实验

1.3.3.1 实验动物

选用健康、成熟，体重25～30g的小鼠50只，雌雄各半。小鼠随机分成5组，每组10只，雌雄各半。

1.3.3.2 剂量和给药方法

实验设2.5、5.0、10.0g/kg BW三个剂量组，分别称取样品5.0、10.0、20.0g，以1%羟甲基纤维素钠为溶媒分别配制成40ml样品液。另设一个阴性对照组（1%羟甲基纤维素钠）和一个阳性对照组（环磷酰胺40mg/kgBW,称取环磷酰胺80mg，加蒸馏水溶解至40ml备用）。小鼠按20ml/kgBW灌胃容量经口灌胃给予受试物，灌胃两次，间隔24小时。于第二次灌胃后6小时颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓制成骨髓片，甲醇固定，Giemsa染色。

1.3.3.3 观察指标

镜检时每只动物计数1000个嗜多染红细胞，计算微核千分率及PCE/NCE值。数据用SPSS统计软件进行统计分析。

1.3.3.4 小鼠骨髓细胞微核实验结果

雌雄各剂量组PCE/NCE比值均未低于阴性对照组 的20%,符合技术规范要求。山里有三牌三七丹参片对小鼠微核率的影响见表3。与阴性对照组比较，雌雄各剂量组微核千分率均无显著性差异 （P＞0.05);阳性 对照组微核率则显著高于阴性对照组，其差异有显著性意义（P＜0.01)。本实验条件下，未见山里有三牌三七丹参片对小鼠骨髓细胞微核率产生明显影响，本次检测结果为阴性。

表3 山里有三牌三七丹参片对小鼠微核率的影响

1.3.4 小鼠精子畸形实验

1.3.4.1 实验动物

选用健康、成熟，体重25～30g雄性小鼠25只。小鼠随机分成 5组，各组5只。

1.3.4.2 剂量和给药方法

实验设2.5、5.0、10.0 g/kg BW三个剂量组，分别称取样品5.0、10.0、20.0g，以1%羧甲基纤维素钠为溶媒分别配制成40ml样品液。另设一个阴性对照组（1%羧甲基纤维素钠）和一个阳性对照组（丝裂霉素C 1.5mg/kgBW,称取丝裂霉素C1.5mg，加生理盐水溶解至20ml备用）。小鼠按20ml/kgBW灌胃容量经口灌胃给予受试物，连续5天，每天1次。于首次灌胃后第35天颈椎脱臼处死动物，取两侧附睾，制成吸滤液直接涂片，自然干燥，甲醇固定，1%伊红染色。

1.3.4.3 观察指标

高倍镜下观察精子形态并计数，每只小鼠计数完整精子1000条，计算精子畸形发生率 （%)。数据用SPSS统计软件进行统计分析。

1.3.4.4 小鼠精子畸形实验结果

山里有三牌三七丹参片对小鼠精子畸形发生率的影响见表4。与阴性对照组比较，各剂量组小鼠精子畸形发生率均无显著性差异（P＞0.05)；阳性对照组则明显高于阴性对照组，其差异有显著性意义 （P＜0.01)，本实验条件下，未见山里有三牌三七丹参片对小鼠精子畸形发生率产生明显影响，本次检测结果为阴性。

表4 山里有三牌三七丹参片对小鼠精子畸形发生率的影响

2 结论

山里有三牌三七丹参片遗传毒性实验：Ames实验、小鼠骨髓细胞微核实验和小鼠精子畸形实验结果均为阴性，该样品未显示有致突变型。山里三牌三七丹参片小鼠经口急性毒性最大耐受量（MTD），雌雄两性均大于20.0g/kgBW，按急性毒性分级标准判定，该样品属无毒级。