绿萝内生真菌中甲醛降解菌的筛选和鉴定

廉佳佩，段乔健，张 云，焦乐乐，李晓军，延文星，张弘弛

(山西大同大学 生命科学学院，山西 大同 037009)

甲醛可以危害到人体的很多方面：其一，甲醛可以直接通过外部皮肤接触引发病症，严重时可能导致皮肤坏死。其二，甲醛浓度超标一般会引起呼吸道疾病，这是因为甲醛能与人体呼吸道蛋白质结合，从而对人体呼吸道造成伤害。目前，甲醛污染的问题引起了国内外诸多专家学者的重视，生物降解的方法在近年来引起了国内外很多学者的关注，生物法降解甲醛具有高效低成本的优点，而且方法简单、更加环保[1-2]。虽然生物法降解甲醛引起了人们的关注，但是如今对于降解甲醛的特殊微生物菌种的研究相对来说还是比较少的，绿萝作为生活中常见的具有净化甲醛作用的植物，被称为“生命之花”，从其内生真菌中分离出对甲醛具有降解作用的真菌对于解决甲醛污染问题，净化生活环境有重要的作用。

1 材料和仪器

1.1 实验材料

样品选为市面销售的普通绿萝，并将其放置于甲醛浓度高于国家甲醛标准0.1 mg/L的新装修室内培养15 d作为实验样品。

1.2 培养基成分

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000 mL，pH自然。

改良察式选择培养基：硫酸铵1.00 g，磷酸氢二钾2.16 g，硫酸镁0.10 g，磷酸二氢钾0.85 g，硫酸镁0.05 g，氯化钙0.03 g，硫酸亚铁0.01 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.0。

察氏培养基：葡萄糖30 g，硝酸钠2 g，磷酸氢二钾1 g，氯化钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蒸馏水1000 mL，pH自然。

1.3 仪器设备及试剂

DHP-600电热恒温培养箱(金坛市国旺实验仪器厂)，LS-7SHD全自动数显立式高压蒸汽灭菌锅(江阴滨江医疗设备有限公司)，SW-CJ-2F超净工作台(昆明普康仪器仪表有限公司)，XMA-600鼓风干燥箱(余姚市亚泰仪表有限公司)，GW-D恒温摇床(北京市六一仪器厂)，UV-3200S紫外/可见分光光度计(上海美国谱达仪器有限公司)，SK210digitall生物显微镜(麦克奥迪事业集团有限公司)；乙酰丙酮溶液、37%甲醛溶液、75%乙醇、3%次氯酸钠溶液、无菌水、蒸馏水等。

2 方法

2.1 样品的处理

在绿萝盆栽样品上剪取正常生长的绿萝叶片，在流水下冲洗叶片表面污物后再用无菌水冲洗干净，然后使其自然风干。风干后对叶面表面进行消毒处理，-步骤如下：先用75%的乙醇溶液浸泡15～30 s，然后用3%的次氯酸钠溶液浸泡10 s，最后再于75%的乙醇溶液中浸泡10 s后用无菌水冲洗2～3次。

2.2 菌种富集培养

在无菌条件下将叶片剪碎后，放置于已灭菌的研钵中研磨成浆，取5 g绿萝叶片浆液，接种于100 mL的PDA液体培养基中进行富集培养，于28 ℃、150 r/min的条件下的恒温摇床中培养10 d。

2.3 甲醛降解菌的筛选

2.3.1 培养基的选择及甲醛溶液的处理

改良察氏选择培养基为此步骤所用的培养基，高压蒸汽灭菌后，待培养基凝固的同时，在无菌条件下进行甲醛溶液的配制，分别配制质量浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200 mg/L的甲醛溶液。

2.3.2 唯一碳源甲醛的添加

待培养基彻底冷却凝固后，吸取10 μL不同浓度的甲醛溶液滴在固体培养基中央，用三角涂布棒将甲醛溶液推向培养皿四周使其均匀分布，每个浓度涂布两个培养基以便作为重复试验，并在培养皿上贴上标签，标示出甲醛溶液的浓度。同时以不添加甲醛而添加无菌水的培养基作为对照。待涂布的甲醛溶液在培养基上完全渗下后，用移液管吸取富集培养液的上清液0.5 mL于固体培养基上，同样用三角涂布棒涂布均匀，在30 ℃培养5 d。

2.3.3 甲醛降解菌的分离纯化

将培养5 d后的菌种在改良察氏选择培养基上进行平板划线操作，在培养基的背面用记号笔标记出划线的四个区域，在第四区域得到所需菌落。继续在改良察氏选择培养基上进行多次的纯种划线操作，直至得到纯的单株菌落。

2.3.4 甲醛降解性能的鉴定

将分离纯化得到的单株菌种接种于甲醛质量浓度为90 mg/L的改良察氏选择液体培养基中，以不加入甲醛而加入无菌水的培养基[3]为对照，在28 ℃、150 r/min的恒温摇床上培养一周，验证该菌种对甲醛的降解性。

2.4 甲醛降解菌E.a-03的鉴定

将分离纯化出的单株菌落利用点殖法接种于察氏培养基上。在点接菌落时，用接种环挑取少量菌种，轻轻点在固体培养基适宜的三个位置上(成三角形状分布)。接种菌种后，于28 ℃培养，从3 d后开始观察其菌落形态并且记录其外观变化和色素产生情况；采用插片培养法观察菌种的菌丝、孢子囊及孢子等形态[4-5]。将分离纯化得到的对甲醛有降解作用的绿萝内生真菌接种于察氏培养基的试管斜面上培养，待菌落长出后交于测试公司进行分子生物学鉴定，将测序后的ITS序列经Blast比对，在进行该菌种系统发育树的构建。

2.5 甲醛降解菌E.a-01的生长曲线及甲醛降解曲线的测定

以改良察氏选择液体培养基为营养培养基，在该培养基中加入浓度为90 mg/L的甲醛溶液作为该菌种可以吸收的唯一碳源，按照10%的接种量[6]用已经灭菌的移液管吸取种子液于150 mL的改良察氏选择液体培养基中，共接种52瓶培养基。封口前先吸取2 mL清液测其降解前的吸光度值OD0并记录，封口后在恒温摇床中28 ℃、150 r/min培养20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200 h时，于每个时间取出3瓶，过滤得到菌丝体于55 ℃烘箱中干燥9 h后，分别在电子天平上称量菌丝干重并取平均值得到每个生长时间段的平均菌丝干重，记录数据。

2.6 甲醛降解曲线的测定[7]

取出培养液过滤后得上清液，用移液管吸取2 mL上清液于25 mL的具塞试管中，然后加入2.5 mL的乙酰丙酮溶液后用振荡器将二者混合均匀后向试管中加入蒸馏水至刻度线，在100 ℃中水浴15 min，待冷却后于波长414 nm下测量其吸光度，以蒸馏水为参照，测出降解后甲醛的吸光度值OD1。测得降解前后甲醛的吸光度值后，利用公式：降解率(%)=(1-OD1/OD0)×100计算出培养过程中不同时间段甲醛的降解率并记录数据。

3 结果与分析

3.1 降解菌鉴定结果

图1 E.a-01菌落特征和显微结构

Fig.1 Colony characteristics and microstructure of E.a-01

图2 E.a-01的系统发育树分析

通过对绿萝内生真菌的筛选，经过多次分离纯化得到一株对甲醛具有降解性能的菌株E.a-01。该株菌种的菌丝生长较为疏松，菌丝大多呈毛絮状生长，培养3 d时菌落表面呈白色；5 d左右逐渐由色素积累，菌落开始呈现淡青色；培养至7 d时，菌落直径达到38～50 mm，菌落表面颜色有明显分别，中间颜色较深呈现黄褐色，外部颜色为青绿色，边缘菌丝呈现白色；长至12 d菌落铺满整个培养皿，从背面观察菌落呈现白绿色(图1)。经过对该菌株的玻片进行显微观察，发现E.a-01的菌丝较为发达，分枝多且明显，为有隔菌丝，孢子囊呈球形，孢子较分散(图1)。

经过对该菌株的测序分析，菌株 E.a-01的ITS序列长度为591bp，菌株E.a-01的系统发育树如图2。BLAST比对结果表明，E.a-01的rRNA-ITS序列和Penicilliumdipodomyicola的序列相似。在系统发育树中，E.a-01与Penicilliumdipodomyicola属于同一分枝。再结合该菌株的形态学特征及其显微结构，可将E.a-01鉴定为青霉Penicilliumdipodomyicola。

3.2 绿萝内生真菌 E.a-01的生长曲线和甲醛降解曲线

图3 内生真菌 E.a-01的生长曲线与甲醛降解率曲线

从图3中我们可以明显的看到，内生真菌 E.a-01的生长曲线与其甲醛降解率曲线在培养时间20～200 h的生长趋势基本上一致。在20～70 h期间，该菌株的生长状况和其对甲醛的降解率均处于较低的状态，且增长幅度不明显，培养50 h后细菌干重仅增加0.879 g，而对于甲醛的降解率仅由4.7%增长到14.7%。可以说细胞在此期间的增长处于延滞状态；当菌体培养到70 h之后，生长曲线和甲醛降解率曲线均有明显的变化，在70～100 h期间，菌体开始大量生长，而其对于甲醛的降解率也开始逐步的上升，说明在此期间菌种开始逐渐的适应生长条件；当培养菌体至100 h后，菌体开始出现对数增长的情况，在100～160 h期间，菌体干重由1.694 g上升至2.870 g，甲醛降解率也由27.8%上升至84.7%，此时菌体对于甲醛的降解率达到最大。在培养160 h之后，细胞开始逐渐衰亡，菌体干重下降较快，而该菌种对于甲醛的降解率呈现直线下降的趋势，在培养至200 h时，菌丝干重下降至1.951 g，而该菌种对于甲醛的降解率则直接下降至41.7%，接近于最高甲醛降解率的一半。说明在培养至160 h之后，营养物质的消耗以及菌体本身代谢的减缓，使得细胞开始自溶逐渐走向死亡。综上所述，绿萝内生真菌 E.a-01的培养时间处于140～160 h时，菌体生长最为茂盛，处于菌体的对数生长期。

4 讨论

将内生真菌E.a-01与其他高效甲醛降解菌相比，该菌的甲醛耐受力以及对于甲醛的降解效率与高效甲醛降解菌还有很大的差距。在后续的试验工作中，期望可以结合基因育种的方法改良该菌株的基因，进而可以提高其对甲醛的耐受力并且进一步提高该菌株对于甲醛的降解效率，希望可以将内生真菌发展成为较为高效的甲醛降解菌，为当今化工行业、家装污染以及废水处理提供更为高效，更为简便，更为环保的方法。