血清miR-223、IL-8联合检测在骨肉瘤诊断中的应用

张 健,王金有,刘泽华,范洪武,梁铂坚，吕佳音

(吉林大学中日联谊医院 骨关节与运动医学科,吉林 长春130033)

骨肉瘤为恶性程度较高骨肿瘤,临床上常见,目前发病年龄具有年轻化的趋势,10岁-25岁为该疾病的主要发病年龄段,年发病率可达3/100万。早期转移是该疾病的特点,约50%的患者在开始诊治时已经发生远处转移,预后较差。侵袭转移和远处血行转移为主要的播散方式。最常见的转移脏器为肺部转移,因早期无明显的临床症状,出现肺转移后5年生存率在30%以下。因此在早期诊断是提高生存率的重要方式。微小RNA(miRNA)是具有调控功能的非编码RNA,不同功能miRNA作用于不同的靶向基因,调控基因的表达。在肿瘤的发生发展过程中,miRNA发挥重要的调控作用。IL-8是能够趋化诱导中性粒细胞的炎性介质,促进炎症反应的过程。近来研究发现,其在多种肿瘤中呈高表达状态[1]。本次研究血清 miR-223在骨肉瘤患者中的表达及临床意义,探究血清IL-8与miR-223联合检测应用于骨肉瘤早期诊断的临床价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年9月至2018年6月我院及协作医院收治的骨肉瘤患者38例(男12例,女26例,年龄15.45±4.20岁),均行根治性骨肉瘤切除术,收集骨肉瘤组织。病例纳入标准：①骨肉瘤的诊断参考《SEOM clinical guidelines for the treatment of osteosarcoma in adults》[2]；②临床资料准确且完整,未进行放疗或者化疗。③由2名病理医师确定病理诊断。另选取同期健康体检者38例(男16例,女22例,年龄17.89±4.93岁)进行对照研究,所有参与者签署知情同意书,同时排除具有可能影响检测结果合并其他疾病的患者。

1.2 检测方法

①实时荧光定量PCR检测miR-223的含量。各称取50 mg肿瘤组织以及癌旁组织,液氮研磨,提取总RNA(Trizol)；RNA核酸定量仪定量并保存于-80℃的环境下。采用北京博奥森生物技术有限公司的反转录试剂盒,按要求配制逆转录反应体系。qRT-PCR采用miScrpt SYBR Green PCR kit方法检测,并按照操作要求配制反应体系。miR-2的上游引物序列为5’-CATGGCATCTGTCTGGCTGCC-3’下游引物5’-AACTCTTGCAATTTGGTC-3’；内参U6上游引物序列5’-CTCGCTGGCAGACAGAC-3’,下游引物序列5’-AACGCTTGACATGGGAAAT-3’,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。95℃条件下预变性5 min,95℃ 10 s,60℃ 20 s,72℃ 20 s,共进行40个循环变性和延伸后收集。反应条件：78℃ 20 s。采用2-△△Ct计算相对基因表达量。②ELISA检测血清IL-8的含量。空腹采取肘部静脉血5 ml,离心去上清,按照试剂盒操作说明书进行检测,试剂盒购自上海宝龙生物科技有限公司。

1.3 统计学分析

2 结果

2．1 血清中miR-223和IL-8在两组中的表达

骨肉瘤组的血清miR-223表达明显降低,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。骨肉瘤组的血清IL-8的表达明显高于对照组,组间比较具有统计学差异(P<0.05)。见表1。经Spearman相关分析显示,二者之间呈低度相关(r=0.318,P<0.05)。

2．2 骨肉瘤组miR-223和IL-8的表达与相关因素关系

分析骨肉瘤患者的临床因素,结果显示,miR-223和IL-8的表达水平与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、肿瘤组织类型无关,差异无统计学意义(P>0.05),而不同转移情况的患者的miR-223和IL-8表达量组间均具有统计学差异(P<0.05)。

表1 骨肉瘤组与对照组的miR-223与IL-8的 表达

表2 骨肉瘤组织miR-223和IL-8的表达与临床病理的 相关分析

*P<0.05**P<0.01

2.3 ROC曲线分析特异度和敏感度

图1所见,采用 SPSS 21.0 绘制ROC的曲线图显示,miR-223、IL-8以及二者联合的曲线下面积(AUC)分别为0.900、0.763、0.937,提示二者联合检测的效能可能高于miR-223和IL-8单一检测(P<0.05)。以约登指数(敏感度+特异度-100%)最大为原则,选择最佳截断值为诊断界值,得到敏感度及特异度，并计算准确度。见表3。

图1 miR-223、IL-8以及二者联合的ROC曲线分析

3 讨论

骨肉瘤的诊断主要包括X线、CT、MRI等放射手段以及血清的碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶检测,但由于骨肉瘤早期常无明显的症状,故在常规体检中很难发现骨肉瘤[3]。往往在出现临床症状或者确诊骨肉瘤时,大多患者已出现转移,延误医治。因此,寻找敏感度高、特异度强的检测方式具有重要的临床意义。miRNA 在真核生物中广泛存在,外周血清中性能稳定且耐酶降解、耐酸、耐碱、耐低温,因此为miRNA成为肿瘤标志物用于检测提供了必要的前提。研究显示,miR-223在多种肿瘤中的表达出现异常[4,5]。在骨肉瘤的研究中,多个miRNA包括miR-7、miR-10b、miR-181、miR-190、miR-214等被认为参与了骨肉瘤的发生、侵袭、转移[6],miR-223也是其中重要一员[7-10]。本次研究显示,骨肉瘤组血清miR-223表达明显降低,与对照组比较差异具有统计学意义。经进一步对比临床资料分析,miR-223表达水平与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、肿瘤组织类型无关,而不同转移情况患者的miR-223表达量具有统计学差异,即miR-223在有肿瘤转移的骨肉瘤患者中有更低的表达,其差异具有统计学意义,这提示在骨肉瘤的发生发展过程中miR-223表达的下降可能是其关键的环节。此前,Dong等人的研究也得出近似的结论,他们在研究中发现,miR-223可以抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭,与miR-223高表达的患者相比,miR-223低表达患者的存活时间显著缩短[11]。这可能意味着miR-223有望成为早期筛查和诊断骨肉瘤以及判断预后的新的标志物。

表3 血清miR-223和IL-8检测骨肉瘤的敏感度和特异度

在肿瘤的生长过程中,炎性介质同样发挥了重要的作用[12,13]。如IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子参与了肿瘤的侵袭、转移。鲁俊杰等的研究发现,IL-8表达异常与骨肉瘤发生发展密切相关[14],IL-8的高表达是骨肉瘤进展的重要依据,对疾病的诊断以及病情的评估具有重要的价值[15]。刘涛等研究显示,IL-8 在循环肿瘤细胞自我种植促进人骨肉瘤细胞增殖及转移中发挥着重要作用,可为骨肉瘤患者早期诊断和治疗提供一个新的策略[16]。本次研究显示,骨肉瘤组的血清IL-8的表达明显高于对照组,组间比较具有统计学差异。其表达水平与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、肿瘤组织类型无关,而在转移情况上表达量的组内比较具有统计学差异,这与上述报道一致。因此,IL-8也可作为骨肉瘤诊断的标志物之一。

由于考虑到恶性肿瘤的检测和诊断过程中,漏诊可能导致的不良后果,我们按照“并联”诊断的原则,即任一指标为阳性者即诊断为阳性,以此来判断联合检测的结果和价值,并同时对比分析了二者单独检测对骨肉瘤诊断的结果和价值。分析结果显示miR-223、IL-8以及二者联合的曲线下面积(AUC)分别为0.900、0.763、0.937。二者联合检测较任一单一检测在敏感度上有了较大幅度的提升,而特异度仅有较小幅度的下降。这点在疑似骨肉瘤患者的早期筛查及诊断方面,有效地减少了漏诊的几率,对临床肿瘤早发现、早诊断、早治疗具有重要的意义,但由于其偏低的特异度,我们认为在临床实际应用中,尚需要结合其他诊断方式进一步排查,避免误诊。由于本次研究的样本数量有限,病患来源相对集中,miR-223诊断的准确性、miR-223与IL-8之间的相关性、联合诊断的可靠性以及是否还有其他更具临床价值的联合检测手段等还需更大样本量进一步实验证实。

本次研究表明,骨肉瘤患者血清miR-223表达下调,与对照组具有统计学差异,有望成为骨肉瘤分子诊断的重要标志物。miR-223和IL-8联合检测具有较高的敏感度,能够有效减少漏诊的几率,提高临床中对骨肉瘤的早期发现和诊断能力,可能成为新的临床筛查、诊断的有效手段,而且可能成为判断骨肉瘤患者预后的一项有效指标。