FeNO与诱导痰细胞分类检测的相关性

陈华萍 唐心蔚 周雪梅 王 子 李 瑾 王关嵩

呼出气一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide, FeNO)检测和诱导痰细胞分类检查作为一种无创性检查方法，越来越多的用于临床，其中FeNO广泛应用于哮喘的诊断、治疗反应的监测以及哮喘患者症状控制情况的评估和急性加重的预测[1-5]。目前FeNO 检测在我国临床应用的时间比较晚，且在诊断哮喘的价值中各国研究结果报道亦不一致[6-8]。诱导痰细胞分类计数亦是评价慢性气道炎症疾病的重要检测手段，在早期哮喘、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary, COPD)的病情判断和疗效监测中都发挥重要作用，特别在嗜酸性粒细胞性支气管炎的诊断中，诱导痰中嗜酸性粒细胞所占比例>3%几乎是该疾病的唯一诊断依据[9-11]。可见，两项检测均在肺部慢性炎症疾病的诊断、治疗和监测中发挥重要价值。FeNO检测和诱导痰细胞分类检查分别与外周血中嗜酸性粒细胞比例具有一定的相关性已有文献报道[12]，然而FeNO与诱导痰细胞检测间的相关性如何，目前这方面的研究报道甚少。我们分析了FeNO与诱导痰细胞分类检测结果的相关性，以期为评估慢性气道疾病的诊治和监测提供指导意义。

资料与方法

一、一般资料

收集第三军医大学新桥医院呼吸内科门诊2018年1月至2018年6月同时检测FeNO和诱导痰细胞分类项目的患者120例。依据FeNO值大于25 bbp分为FeNO正常组和升高两组，其中FeNO正常组(FeNO值=16.28±5.77)男性19例，占33.9%，女性37例，占66.1%，平均年龄(47.18±10.88)岁；FeNO升高组(FENO值=57.36±5.89)男性28例，占43.7%，女性36例，占56.3%，平均年龄(43.29±12.63)岁。患者入选标准为：①18岁≤年龄≤75岁，性别不限；②有较好的依从性，能配合进行FeNO检测和诱导痰白细胞分类检测。排除标准: ①4周内全身使用或吸人糖皮质激素；②不能配合FeNO 测定及诱导痰白细胞分类检测者。FeNO判定标准：≤25 ppb，正常；≥25 ppb，升高。诱导痰白细胞分类检测参考值标准参考我们前期的研究结果[13]：细胞总数：(3.48±3.97)×106/g；嗜酸性粒细胞比例：(0.07±0.21)%；中性粒细胞比例：(37.02±13.68)%；淋巴细胞比例：(2.90±2.22)%；巨噬细胞比例：(60.7±13.67)%。

二、检测方法

1. FeNO检测: 以无锡纳库伦公司SV42E测定系统检测患者FeNO值。检测前向患者充分解释收集气体标本的呼吸方法，同时观看录像，直至患者完全理解。在FeNO测定系统声光和内置动画软件的提示下，引导患者采用正确的呼气方法，呼出气流速依据美国胸科协会(ATS)及欧洲呼吸学会(ERS)测定指南进行[14]。嘱咐患者先将肺部内的气体尽量呼出，然后用口唇紧包过滤器，尽量用力吸气5 s，然后再次嘱咐患者用平稳的气流速度再次将肺部内的气体排出，并维持10 s左右，大约90 s后读取仪器上显示的数值。测定结果以ppb表示，所有患者的FeNO检测均安排在诱导痰检测之前进行。

2. 诱导痰细胞分类检测

(1)雾化： 入选患者雾化前给予清水漱口，擤鼻以减少口中唾液的污染。高频超声雾化吸入3%高渗盐水约10 min后，深部咳痰液于痰盒内。若患者前述雾化后仍无痰液咳出，或痰量不足，即换用4%高渗盐水持续超声雾化5 min，若仍无痰或痰量不足时，则换用5%高渗盐水再雾化，5 min后则终止诱导雾化程序。

(2)痰液的选取： 选用诱导的痰液中黏稠的部分，同时显微镜下观察痰液标本，选取无鳞状上皮污染的痰液，丢弃唾液，留下合格的痰液标本(镜下每个低倍视野鳞状上皮细胞小于10个，中性粒细胞大于25个/视野)。

(3)痰液的处理： 将合格的痰液装于5 ml离心管中，称其质量(>0.5 g)，合格痰中加入4 ml的0.1%二硫苏糖醇(DTT， DTT可将痰液中糖蛋白纤维丝之间的二硫键打开，使得痰液溶解, 使其中的细胞分散，且其对细胞形态无破坏作用，不影响细胞计数)，充分混合。将装有痰液的离心管置于37 ℃水浴锅中消化10 min，中途摇晃几次，待痰液完全消化后，用48 μm的尼龙网过滤痰液，滤掉其中的黏液和碎片。收集痰液，以离心半径8 cm，2 000 r/min离心10 min，去掉上清。向离心管底的细胞沉淀用200 μl磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，取20 μl细胞混悬液于细胞计数板中进行细胞总计数，所得细胞总数计算为细胞数除以质量，最终表达为：细胞个数×106/g。将剩余细胞混悬液用于细胞涂片，将涂片于37 ℃烤干后用甲醇固定10 min，瑞氏-吉姆萨混合染色10 min，冲掉染色液，于烤片机上37 ℃烤干后光镜下进行400个非鳞状细胞分类计数，包括嗜酸性粒细胞(eosinophile granulocyte, EOS)、中性粒细胞(neutrophile granulocyte, NEU)、单核一巨噬细胞(Monocyte macrophage, MON)、淋巴细胞(leukomonocyte, LYM)，计算各细胞所占比例。注意，痰液标本处理过程最好在2 h内完成。

三、统计学方法

结 果

根据FeNO判定标准：正常，FeNO值≤25 ppb；升高，FeNO值≥25 ppb。其中FeNO正常组，其中FeNO正常组(FeNO值=16.28±5.77)诱导痰细胞分类中细胞总计数(5.16±3.77)、嗜酸性粒细胞百分比为(1.18±1.99)%、中性粒细胞百分比(56.47±18.09)、淋巴细胞百分比(5.86±6.08)、单核-巨噬细胞百分比(35.12±14.47)；FeNO升高组(FeNO值=57.36±5.89)诱导痰细胞分类中细胞总计数(4.96±1.76)、嗜酸性粒细胞百分比为(11.56±12.80)%、中性粒细胞百分比(50.43±15.27)、淋巴细胞百分比(4.95±3.02)、单核-巨噬细胞百分比(31.33±13.28)；结果显示FeNO值升高组较FeNO值正常组FeNO值和嗜酸性粒细胞百分比均显著升高，且FeNO水平与诱导痰嗜酸性粒细胞百分比呈正相关，相关系数为0.701，两组间细胞总数、中性粒细胞比例、淋巴细胞比例和单核巨噬细胞比例均无显著性差异(P>0.05)，见表1。

表1 两组间诱导痰细胞分类结果对比

注：aP< 0. 05，与FeNO 正常组比较

讨 论

FeNO主要来自支气管壁气道上皮细胞、T 细胞、巨噬细胞，由于炎症因子的刺激，上调诱导型一氧化氮合酶(nitric oxide synthetase, NOS)，使NO产生增加，FeNO水平升高，可反映哮喘患者气道炎症严重程度[15]。目前研究表明NOS在哮喘患者的炎症细胞和气道上皮中表达较多，而在其他非哮喘患者细胞中表达较少，导致哮喘患者FeNO水平显著升高[16]，这些奠定了FeNO检测在哮喘的诊治和临床控制水平中的重要价值。诱导痰细胞分类计数检测通过染色的方法可直观的观察患者痰中的各种细胞比例，其被作为判断哮喘患者炎症反应表型的金标准，在临床应用中诱导痰细胞分类除了用于判断和监测哮喘患者病情外，在慢性阻塞性肺疾病等其他肺部炎症控制中也有一定指导意义。

从方法学角度分析，FeNO检测具有无创、简便、高效、快速、可重复性较好、测量能够标准化等优点，既往研究亦表明FeNO测定能有效地监测炎症变化和指导抗炎治疗[17]。但是FeNO测定容易受到众多因素的干扰，影响结果的准确性，如患者疾病的状态、性别因素、吸烟和糖皮质激素以及种族等[18]。而诱导痰细胞分类检测亦作为一种无创的检测方法，其费用低廉容易被患者接受，目前其在临床上的应用已积累了丰富的经验，在哮喘、COPD、慢性咳嗽、肺结核等呼吸道疾病中有广泛应用，在2015年全球哮喘防治倡议(GINA)以及各个国家哮喘防治指南中均得到推荐[19-20]。但是诱导痰细胞分类检测操作程序较复杂耗时、检测流程未标准化、各国无统一的参考值，以及需要专业的技术人员来操作等缺点。

从两者在临床应用角度分析，FeNO在哮喘的诊断和评价哮喘的治疗反应和急性加重中已有广泛应用，资料显示FeNO<25 ppb时提示嗜酸粒细胞炎症可能性低，而 FeNO>50 ppb则提示嗜酸粒细胞性哮喘[21]。FeNO检测亦可用于预测吸入激素治疗慢性咳嗽的反应性，以及鉴别COPD患者嗜酸性粒细胞的气道炎症表型[22]。诱导痰细胞分类检测是鉴别慢性咳嗽(咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma, CVA)、鼻后滴流综合征、胃-食管反流性咳嗽以及嗜酸性粒细胞支气管炎(eosinophil bronchitis, EB))中EB的唯一方法，因为EB缺乏特征性的临床表现，且部分临床表现与CVA类似，其体格检查亦无异常，EB的诊断目前主要依据诱导痰细胞分类中嗜酸性粒细胞百分百>3%判定。其次，诱导痰细胞分类检测在哮喘的诊治中可用于评价哮喘患者的气道炎症严重程度，以及药物疗效。在COPD的应用中诱导痰中性粒细胞数目可与肺功能联合判断患者的气道炎症情况。

本研究通过比较患者FeNO值与诱导痰中各细胞比例的关系发现，FeNO值升高的患者其诱导痰中嗜酸性粒细胞比例也显著升高(P<0.05)，FeNO值正常的患者诱导痰中嗜酸性粒细胞比例也较FeNO升高组显著降低(P<0.05)，相关性分析显示FeNO水平与诱导痰嗜酸性粒细胞水平呈正相关(r=0.697)，说明两种检测手段结果一致性较好，均可反映气道炎症水平，这与文献报道结果相一致[23]，诱导痰嗜酸性粒细胞作为气道炎症的重要生物学标志物，其水平亦可反映气道炎症的严重程度，FeNO检测亦主要用于评价哮喘患者嗜酸性炎症。

综上，FeNO检测和诱导痰细胞分类检测在应用范围和操作流程上均有自己的优缺点，但二者都不能被其中一个所取代，两者互相弥补了各自的缺点。因此，在临床应用中，将FeNO检测和诱导痰细胞分类检测有机的结合起来评价和监测慢性呼吸道疾病炎症水平，对提高对患者疾病的管理和监测，也可为哮喘、嗜酸性粒细胞性支气管炎和COPD诊治和管理提供重要的辅助工具。